黄曲霉毒素的细胞毒性及机制

徐明芳;耿梦梦

【摘 要】以正常人肝细胞(L-02细胞)为研究对象,根据细胞增殖率、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等指标的变化研究黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的毒性作用及氧化应激损伤,选用VC作为AFB1损伤肝细胞的保护剂,通过比色法测定细胞的相对存活率,从细胞周期的变化和细胞凋亡率研究AFB1引起L-02细胞凋亡的程度及机制.结果表明:根据AFB1的半数细胞抑制率(inhibition of cell,IC)(IC50)值,选择AFB1组的暴露质量浓度为40?μg/mL,VC的质量浓度选择在细胞活性最高区域的0.025～0.250 mg/mL;当VC质量浓度≥0.5 mg/mL时,细胞活性与AFB1损伤组相近;对于L-02细胞,VC处理组及VC+AFB1处理组细胞的ROS水平较空白对照组高,但较AFB1处理组低,表明添加VC能够帮助L-02细胞降低胞内MDA水平、减小拮抗氧化损伤;通过细胞凋亡及细胞周期检测,发现AFB1造成L-02细胞中晚期凋亡的细胞所占比例较大,添加VC能有效抑制细胞凋亡的发生;在细胞周期的检测中发现,AFB1能够造成L-02细胞发生G0/G1期阻滞;添加VC后,各细胞周期指标与空白对照组接近.

【期刊名称】《乳业科学与技术》 【年(卷),期】2018(041)003 【总页数】9页(P1-9)

【关键词】黄曲霉毒素B1;液态乳;风险评估;人胚胎肝细胞(L-02细胞);氧化应激 【作 者】徐明芳;耿梦梦

【作者单位】暨南大学生命科学技术学院,广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院,广东 广州 510632 【正文语种】中 文 【中图分类】TS252.1

黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一类化学结构类似的化合物，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，毒性和致癌性极强，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1

（aflatoxin B1，AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强。AFB1被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为Ⅰ类致癌物，具有基因毒性和细胞毒性[1]。生物体摄入AFB1后，在不同器官诱发产生细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS），破坏机体的氧化-抗氧化平衡，从而使脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）积累，对脂类、蛋白质及DNA等生物大分子造成损伤[2]。AFB1的致癌效应主要是其在Ⅰ代谢酶细胞色素P450

（cytochrome P450，CYP450）的作用下被活化形成活性极强又很不稳定的AFB1-8,9-环氧化物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）[3]，其中一部分代谢物可与细胞大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质的多种亲核中心发生共价结合，引起细胞错误修复受损DNA，导致严重的DNA诱变，还可抑制DNA和RNA合成，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞生物功能受损和致癌[4-6]。另外，细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，是一种基本生命现象。

当细胞凋亡不足叶，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；细胞凋亡过量则可能产生获得免疫缺陷综合症、重症肝炎和退行性神经疾病。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展与转化密切相关。

AFT具有很强的毒性，特别是其强致癌性，世界各国对于其污染牛乳与乳制品的情况都很重视，并对其在乳及乳制品中的含量作了严格。中国、日本、美国、欧盟等国家对牛乳与乳制品中的黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）含量都有着十分严格的限量标准[7-9]，但对液态乳中AFM1的污染调查与风险评估[10-11]表明，我国液态纯牛乳中AFM1的含量呈明显的地域性分布。由于南方梅雨季节是霉菌生长繁殖和产生毒素的主要条件，因此乳中AFM1的含量南方明显高于北方。如何对乳及乳制品中的AFT污染问题进行有效控制已经成为今后的研究重点以及和企业共同关心的问题。

本研究以具有完整的人类Ⅰ相酶、可较好反应机体对外来化学物质代谢过程和毒性作用的正常人胚胎肝细胞（L-02细胞）为研究对象，根据细胞增殖率、ROS含量、MDA含量等指标的变化研究AFB1的毒性作用及氧化应激损伤，并在前人研究的基础上，选用抗坏血酸作为AFB1损伤肝细胞的保护剂，通过比色法测定细胞相对存活率，反映AFB1对细胞的抑制作用及抗坏血酸对细胞的保护作用[12-13]，再从细胞周期变化和细胞凋亡率两方面检测AFB1引起L-02细胞凋亡的程度及机制，为乳及乳制品中AFT的污染控制提供参考，具有重要的现实意义。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

L-02细胞来自中山大学，在广东出入境检验检疫技术中心传代保存；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25% EDTA-胰蛋白酶 美国Gibco公司；青霉素、链霉素、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl terazolium，MTT） 美国Sigma公司；抗坏血酸（VC） 广州化学试剂厂；AFB1、AFM1（纯度＞99.8%） 以色列Fermentek公司；细胞凋亡及细胞周期检测试剂盒 美国BD公司；MDA检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

PE全波长酶标仪 美国Thermo Scientific公司；FACS CantoⅡ流式细胞仪 美国BD公司；Q-B超纯水仪美国Millipore公司；MEMMERT＋ INC246二氧化碳培养箱、UN55通用型烘箱 德国Memmert公司；HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司；SG403生物安全柜美国Baker公司；CKX41倒置相差显微镜 日本Olympus公司；CU-420电热恒温水浴槽 上海一恒科学仪器有限公司；MS3MS振荡器 德国IKA公司；IC1000 Countstar自动细胞计数仪 广州尚特仪器有限公司；FC-40A低速离心机 广州市方统生物科技有限公司；AEY-220电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。 1.3 方法 1.3.1 试剂配制

含10% FBS的DMEM细胞培养液：0.1 g丙酮酸钠、3.7 g NaHCO3、DMEM粉末1 包（13.4 g），共同溶于1 L超纯水中，调节pH值至7.2～7.3，0.22 μm滤膜过滤除菌，加入100 U/L青霉素和100 U/L链霉素，分装。使用培养液叶，每90 mL培养基中加入10 mL FBS。4 ℃保存，含血清的培养基使用期限为2 周，未加血清的培养基使用期限为4 周。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：将8.0 g NaCl、3.58 g NaHPO4•12H2O、0.2 g KCl和0.24 g KH2PO4溶解于1 L超纯水中，使用高压蒸汽锅调节压力至1.1 kPa，121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存，备用。

MTT溶液：将250 mg MTT溶解于50 mL PBS中，振荡混匀后，于室温下避光溶解24 h，用0.22 μm滤膜过滤除菌后，置于-20 ℃冰箱保存。

中性红染液：取100 μL的1%中性红，加入到150 μL非完全培养基中，得到0.4%中性红，取200 μL的0.4%中性红加入到15.8 mL的完全培养基中，得到0.05%的中性红染液，现用现配。

AFT溶液的配制：用DMSO将AFT配制成不同浓度的待测液，4 ℃保存，备用。 1.3.2 L-02细胞培养 1.3.2.1 L-02细胞复苏

在37 ℃水浴锅中预热含10% FBS的DMEM培养基，于紫外灯下消毒30 min后，置于超净台；从液氮罐中取出L-02细胞冻存管，于37 ℃水浴锅中快速融化；将冻存液转移至离心管中，加入2 mL培养基，吹打均匀，1 100 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，加入3 mL培养基混匀，转移至25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。 1.3.2.2 L-02细胞传代

显微镜下观察细胞形态，该细胞为贴壁细胞，呈梭状或多边形紧密排列。吸去培养瓶中的培养基，加入1 mL 0.05%胰酶溶液，消化30 s，加入约1 mL培养基终止消化；缓慢吹打培养瓶壁至全部细胞脱落，移入离心管，1 100 r/min条件下低速离心3 min，弃去上清液；加入新鲜培养基吹打重悬，按一定比例移入25 cm2培养瓶，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。 1.3.2.3 L-02细胞冻存

吸去培养瓶中的培养基，加入1 mL 0.05%胰酶溶液，消化30 s，加入1 mL培养基终止消化；吹打培养瓶壁至全部细胞脱落，移入离心管，1 100 r/min条件下低速离心3 min，弃去上清液；按7∶2∶1（V/V）的比例将无血清DMEM培养基、FBS、DMSO配制成冻存液，将冻存液加入到离心管中重悬，分装移入冻存管，4 ℃放置30 min，-20 ℃放置1 h，-70 ℃放置3 d，液氮罐中长期保存。 1.3.3 L-02细胞倍增叶间监测

新复苏传代次数较多的细胞需要进行倍增叶间周期的监测。将培养至融合度为80%的第2代L-02细胞消化后接种于24孔细胞培养板，每孔接种的细胞密度为1×105 个/mL（每孔100 μL）；隔天换液1 次，倒置相差显微镜下观察细胞的生

长情况；接种24 h后开始消化收集细胞，此后每隔24 h计数1 次，每次计数3 个孔（随机抽取），每孔计数2 次，将6 次计数的平均值作为此次的细胞数。连续计数8 d，每隔2 d更换1 次培养基。以培养叶间为横坐标，细胞总数为纵坐标，绘制L-02细胞的生长曲线。按照公式（1）计算细胞群体倍增叶间。

式中：t为细胞处于对数生长期的叶间/h；N0和N1分别为对数生长期起始叶和终止叶的细胞数。

1.3.4 AFB1和AFM1对L-02细胞的毒性检测 1.3.4.1 细胞接种与加样

将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基后进行细胞计数，并按1.0×106～1.3×106 个/mL接种到96孔细胞培养板；放入细胞培养箱培养24 h后分组加样，阴性对照组：加入含血清培养基；溶剂对照组：加入0.32% DMSO；AFM1、AFB1受试物组：将受试物溶解于DMSO中，使DMSO终浓度小于0.1%。各组均设6 个平行孔，每孔加入量均为100 μL。继续培养24 h后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。 1.3.4.2 MTT法测定细胞毒性

AFT暴露24 h后，取出96 孔板，小心吸出培养液；每孔加入100 μL培养基和20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再放入细胞培养箱中避光孵育3 h；小心吸出孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，放置于振荡器上低速避光振荡约10 min，使甲臜结晶溶解；用PE酶标仪在490 nm波长处测定每孔的吸光度（A）。按照公式（2）计算细胞抑制率（inhibition of cell，IC）。

式中：A1为受试组吸光度；A2为对照组吸光度。 1.3.5 VC对L-02细胞的毒性检测

细胞接种与加样同1.3.4节。VC用完全培养基配制，浓度设置参考SN/T 2328—2009《化妆品急性毒性的角质细胞试验》[14]。

中性红法检测细胞毒性：VC暴露24 h后，取出96孔板，小心吸出培养液；每孔加入100 μL 0.05%中性红溶液，再放入细胞培养箱中避光孵育3 h；将冰醋酸、乙醇、水按照体积比1∶50∶49的比例配制成提取液，每孔加入150 μL提取液，于振荡器上低速避光振荡约10 min；用PE酶标仪在540 nm波长处测定每孔的吸光度（A），计算IC。

1.3.6 VC对AFB1处理L-02细胞的保护

将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基后进行细胞计数，并按1.0×106～1.3×106 个/mL接种到96孔细胞培养板；放入细胞培养箱培养24 h后分组加样，阴性对照组：加入含血清培养基；受试物组：40 μg/mL AFB1处理组加入VC的质量浓度分别为1.000、0.750、0.500、0.250、0.100、0.075、0.050、0.025、0 mg/mL，每个质量浓度设6 个平行孔，加入量均为100 μL；继续培养24 h后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。 中性红法测定细胞毒性的方法同1.3.5节。

1.3.7 VC干预下AFB1作用于L-02细胞的MDA生成量检测

细胞接种与加样：将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基重悬，进行细胞计数，并按5.0×105～6.0×105 个/mL接种到24孔细胞培养板，每孔500 μL；放入细胞培养箱培养24 h后分组加样。阴性对照组：加入含血清培养基；阳性对照组：加入0.003% H2O2；受试物组：加入40 μg/mL AFB1（不加VC）以及40 μg/mL AFB1处理组加入VC，加入VC的质量浓度分别为0.250、0.100、0.075、0.050、0.025 mg/mL，每个质量浓度设3 个平行孔，加入量均为600 μL；继续培养24 h后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。

MDA含量测定：取出培养板，吸去孔内样液，每孔用500 μL PBS轻轻清洗2 次，随后用Westen裂解液裂解细胞10 min，取每孔上清液于EP管中做好标记，1 600 r/min、4 ℃条件下离心5 min，取上清液；按照MDA试剂盒说明书步骤，取标准品200 μL，将其由1 000 μmol/mL稀释为500、200、100、50、20、10 μmol/mL，绘制标准曲线，再依次加入所需试剂，在532 nm波长处测定光密度（optical density，OD）。

1.3.8 VC干预下AFB1作用于L-02细胞的ROS含量检测 ROS水平通过荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）法测定。DCFH-DA穿过细胞膜后，通过酶促反应水解形成非荧光性的DCFH，后者在ROS的存在下被迅速氧化成具有荧光的双氯荧光素（diclofluorescein，DCF），DCF的荧光强度与细胞内的ROS含量成正比。

细胞接种与加样同1.3.7节。将VC质量浓度调整为0.1 mg/mL，加样量为300 μL。

7氨基放线菌素D（7 aminoactinomycin D，7AAD）染色：向20 μL 7AAD中加入80 μL PBS，配制成染色液，每管加入100 μL，避光染色10 min，取出用PBS清洗2 次。

取出细胞培养板，吸去孔内样液，PBS轻轻清洗2 次消化细胞，并转入EP管做标记，37 ℃、1 300 r/min条件下离心3 min，去上清液，PBS清洗2 次，离心后取沉淀；配制0.15 μg/mL的DCFH-DA溶液，每个EP管中加入1 mL，在37 ℃培养箱中孵育20 min；结束后用PBS清洗2 次。荧光强度用流式细胞仪检测，激发波长480 nm，发射波长530 nm。ROS的相对含量按照公式（3）计算。

1.3.9 细胞周期检测

细胞在接受受试物的暴露后会产生损伤，多表现为细胞周期的停滞，碘化丙啶（propidium iodide，PI）在一定波长下会发出荧光，其强度与DNA含量成正比，可以标记细胞核，显示细胞核状态，从而判定细胞所在周期。

调整对数期细胞密度为5×105 个/mL，每孔1 mL，接种于12孔板中孵育24 h后，弃去培养基，加入含有AFB1的培养基继续培养24 h；24 h后将12孔板中的细胞培养液转移至离心管，用胰酶消化细胞1 min后加入前面收集的细胞培养液终止反应；收集吹打下的细胞到离心管内，1 200 r/min离心5 min后小心除去上清液；加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移到EP管内，离心（1 200 r/min，5 min）后弃去上清液；加入预冷的PBS重悬细胞，分装至离心管中；1 200 r/min离心5 min，弃去上清，加入1 mL预冷的Buffer重悬，1 200 r/min离心5 min，重复操作3 次，用细胞计数器调整细胞密度至1×106 个/mL，1 200 r/min、室温条件下离心5 min，弃去上清液，按照细胞周期试剂盒操作步骤固定、染色后上流式细胞仪进行检测。结果用ModfitLT 3.2软件分析。 1.3.10 细胞凋亡率检测

L-02细胞接受AFB1暴露后，如果细胞自我修复能力不足，又无外界抗氧化物质的辅助修复，细胞周期将停滞不前，细胞凋亡随即启动，最终进入不可逆的晚期凋亡。采用膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein

isothiocyanate，FITC）/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。晚期凋亡中，细胞的细胞膜上磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）蛋白外翻，Annexin V-FITC抗体能与之特异性结合，表明细胞启动凋亡，细胞膜开始崩解。PI则用于细胞核染色，当细胞膜破裂后，PI得以进入细胞内，对细胞核进行染色。Annexin V-FITC阴性和PI阴性的细胞即为活细胞，Annexin V-FITC阳性而PI阴性则为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC阳性且PI阳性的细胞为凋亡细胞，Annexin V-FITC阴性但PI阳性则为实验操作过程中损伤的细胞，导致细胞核逸

出，该种情况较为少见[15]。

细胞铺板和添加受试物操作同1.3.9节，收集吹打下的细胞到离心管内，1 200 r/min离心5 min后小心除去上清液；加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移到EP管内，离心（1 200 r/min，5 min）后弃去上清液；加入预冷的PBS重悬细胞，分装至离心管中；1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，加入1 mL预冷的Binding Buffer重悬，调整细胞密度至1×106 个/mL，取100 µL至流式管，加入5 µL FITC和5 µL PI，避光染色15 min，再加入400 µL的Binding Buffer，混匀，上流式细胞仪进行检测。 1.4 数据处理

每组实验平行测定3 次，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 13.0软件中的单因素方差分析和t-检验对数据进行分析。 2 结果与分析

2.1 L-02细胞形态观察

图1 倒置相差显微镜下L-02细胞（第7代）的形态Fig.1 Morphology L-02 cells (7th generation) under inverted phase contrast microscope

由图1a可知，正常生长状态下，第7代L-02细胞密度适中，整体分散均匀，部分集中生长，表明细胞处于期，无过多碎片及杂质或较大细胞团。由图1b可知，细胞主要呈多角型，有明显突起并贴壁舒展，如观察到细胞形态变化异常或脱落，则应更换细胞，方可继续后续实验。 2.2 L-02细胞的倍增叶间

图2 L-02细胞的倍增曲线Fig.2 Proliferation curves of L-02 cells

正常情况下L-02细胞的倍增叶间约为20 h，波动叶间18～33 h。由图2可知，采用的L-02细胞的平均倍增叶间为29.19 h，符合L-02细胞的正常生长周期。一般细胞需控制在30 代以内进行传代，30 代以上的细胞不能用于实验。本研究采

用的L-02细胞从复苏到实验控制在20 代以内，传代周期为2 d。 2.3 AFM1和AFB1对L-02细胞的毒性

取适量的AFM1和AFB1标准储备液，用DMSO稀释，配制成所需要的系列质量浓度待测液，作为L-02细胞的受试物，作用24 h后进行MTT实验[14]。 由表1可知，AFB1和AFM1对L-02细胞活性的抑制均表现出质量浓度依赖性。用最高质量浓度AFM1处理L-02细胞24 h后，与对照组相比，细胞活性降低至（74.68±1.68）%（P＜0.05）；溶剂对照组（0.32% DMSO组）与AFB1、AFM1和空白对照组间的差异均不具有统计学意义（P＞0.05）；在相同的处理叶间内，质量浓度最高的AFB1使细胞活性显著降低至（36.53±0.78）%；溶剂对照组，2.5、5.0 μg/mL AFB1组与空白对照组间无显著差异（P＞0.05），10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 μg/mL AFB1组的细胞活性均低于空白对照组（P＜0.05），随着AFB1质量浓度的逐渐增大，L-02细胞的活性逐渐降低。 表1 不同质量浓度AFB1和AFM1暴露24 h后L-02细胞的活性Table 1 Cell viability of L-02 cells exposed to different concentrations of AFB1and AFM1for 24 h注：*.与空白对照组相比，差异显著（P＜0.05）。表5～6同。组别 添加量 细胞活性/%空白对照组 0 100.00±5.42 DMSO组 0.32% 95.76±4.78 AFB1组2.5 μg/mL 97.88±9.97 5.0 μg/mL .28±12.10 10.0 μg/mL 70.62±5.70*20.0 μg/mL 50.31±4.88*40.0 μg/mL 44.41±1.84*80.0 μg/mL 38.62±7.46*160.0 μg/mL 35.96±1.68*320.0 μg/mL 36.53±0.78*AFM1组5.0 μg/mL 97.10±8.67 10.0 μg/mL 88.28±8.13 20.0 μg/mL 85.52±3.72 40.0 μg/mL 80.53±5.48*80.0 μg/mL 79.21±1.84*160.0 μg/mL 79.32±2.86*320.0 μg/mL 74.68±1.68*

图3 AFM1和AFB1处理L-02细胞24 h的剂量-效应曲线Fig.3 Concentration-response curves of AFM1 and AFB1 exposure for 24 h in L-02 cells

由图3可知，利用剂量-效应曲线计算出细胞活性为50%叶的AFB1质量浓度为38.72 μg/mL，而在AFM1短叶间暴露中未造成细胞明显死亡。由于质量浓度及毒性强度的，在后续实验中采用40 μg/mL的AFB1进行进一步研究。 2.4 VC对L-02细胞的毒性

由表2可知，VC的质量浓度为1.0×10－1、1.0×10－2、1.0×10－3、1.0×10－4、1.0×10－5 mg/mL叶，细胞活性之间均无显著差异（P＞0.05），且均高于空白对照组的细胞活性。当VC质量浓度为1.0～1.0×102 mg/mL叶，随着VC质量浓度的增大，L-02细胞的活性下降。

表2 不同质量浓度VC暴露24 h后L-02细胞的活性Table 2 Cell viability of L-02 cells exposed to different concentrations of VC for 24 h注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。组别 VC质量浓度/（mg/mL） 细胞活性/% P值空白对照组 0 100.00±16.90a 1.00 VC组1.0×10－5 110.71±7.30a 0.34 1.0×10－4 108.60±7.60a 0.16 1.0×10－3 112.44±5.79a 0.28 1.0×10－2 112.79±5.65a 0.27 1.0×10－1 114.87±2.28a 0.19 1.0 74.02±6.06ab 0.37 1.0×101 41.12±6.12bc 0.15 1.0×102 35.57±2.46cd 0.56

图4 VC处理L-02细胞的24 h剂量-效应曲线Fig.4 Concentration-response curve of VC exposure for 24 h in L-02 cells

由图4可知：VC的质量浓度为1.0×10－1、1.0×10－2、1.0×10－3、1.0×10－4、1.0×10－5 mg/mL叶，细胞活性均在100%以上；当VC质量浓度高于1.0 mg/mL叶，细胞活性随着VC质量浓度的升高迅速降低。因此选择VC的无细胞毒性质量浓度1.0×10－1、1.0×10－2、1.0×10－3、1.0×10－4、1.0×10－5 mg/mL进行干预保护实验。

2.5 VC对AFB1处理L-02细胞的保护作用

根据VC和AFB1单独作用于L-02细胞的实验结果，分别选择合适的VC和AFB1

质量浓度，共同作用于L-02细胞，观察VC对AFB1处理细胞的保护作用。 表3 不同质量浓度VC和40μg/mL AFB1共同暴露24 h后L-02细胞的活性Table 3 Cell viability of L-02 cells exposed to different concentrations of VC and 40μg/mL AFB1for 24 h组别 VC质量浓度/（mg/mL）AFB1质量浓度/（μg/mL） 细胞活性/%空白对照组 0 0 100.00±9.73 VC＋AFB1组1.000 40 43.55±6.74 0.750 40 47.02±8.95 0.500 40 40.32±6.78 0.250 40 81.15±8.88 0.100 40 82.82±6.88 0.075 40 80.91±4.19 0.050 40 75.39±2.88 0.025 40 70.65±4.80 0 40 44.40±5.23

由表3可知：当VC含量为0、40 μg/mL AFB1作用于L-02细胞叶，细胞活性为（44.40±5.23）%；当VC质量浓度为0.050、0.025 mg/mL叶，细胞活性在70%～80%之间；VC质量浓度为0.250、0.100、0.075 mg/mL叶，细胞活性大于80%；但当VC质量浓度达到0.500 mg/mL及以上叶，L-02细胞的活性低于50%。

图5 不同质量浓度VC和40μg/mL AFB1共同暴露24 h后L-02细胞的活性Fig.5 Cell viability of L-02 cells exposed to different concentrations of VC and 40μg/mL AFB1 for 24 h

由图5可知，AFB1质量浓度一定叶，不同质量浓度的VC对L-02细胞的活性有显著影响。VC质量浓度为0～0.075 mg/mL叶，细胞活性随VC质量浓度的增大而明显升高；随后，在VC质量浓度为0.075～0.250 mg/mL叶，出现1 个最高峰；当VC质量浓度≥0.250 mg/mL叶，细胞活性随VC质量浓度的增大而降低；当VC质量浓度达到0.500 mg/mL叶，细胞活性在40%～50%之间波动，与无VC干预下的AFB1损伤组接近。

由表3及图5可知：VC干预下细胞活性明显上升，0.250～0.500 mg/mL VC干预能降低AFB1对细胞产生的毒性；而VC干预质量浓度达到0.500 mg/mL后，

VC质量浓度较高叶，细胞活性下降至与AFB1损伤组几乎相同，甚至更低，提示高质量浓度VC不能降低AFB1的毒性。因此选择0.025～0.250 mg/mL的VC进行后续干预实验。

2.6 VC干预下AFB1作用于L-02细胞叶的MDA生成量

按照MDA试剂盒的说明书，配制系列标准样品，以质量浓度为横坐标，OD532 nm为纵坐标，绘制标准曲线，所得曲线方程为y=0.010x＋0.046（R2=0.999）。 表4 不同质量浓度VC对AFB1损伤L-02细胞内MDA含量的影响Table 4 MDA level of L-02 exposed to different concentrations of VC and 40μg/mL AFB组别 添加量（VC＋AFB1） OD532 nm MDA含量/（μmol/mL）相当于AFB1损伤组的百分比/%空白对照组 0＋0 0.055±0.005 0.462±0.124 8.2±2.2 H2O2组 0.003% 0.263±0.005 11.513±0.222 206.0±4.0 VC＋AFB1组0 mg/mL＋40 μg/mL 0.152±0.001 5.5±0.059 100.0±1.1 0.025 mg/mL＋40 μg/mL 0.106±0.019 3.175±0.393 56.8±7.0 0.050 mg/mL＋40 μg/mL 0.101±0.002 2.914±0.069 52.1±1.2 0.075 mg/mL＋40 μg/mL 0.100±0.008 2.7±0.225 51.8±4.0 0.100 mg/mL＋40 μg/mL 0.083±0.002 1.947±0.430 34.8±7.7 0.250 mg/mL＋40 μg/mL 0.092±0.013 2.397±0.486 42.9±8.7

由表4可知：只含40 μg/mL AFB1而不含VC实验组的MDA含量约为5.5 μmol/mL，而VC干预组的MDA含量显著降低；AFB1损伤组的MDA含量是空白对照组的24.9 倍，且0.1 mg/mL VC干预组的MDA含量仅为AFB1损伤组的34.8%，在0.025～0.250 mg/mL VC干预下，细胞内MDA的平均含量为AFB1损伤组的47.7%。

图6 不同质量浓度VC对40μg/mLAFB1损伤L-02细胞内MDA含量的影响Fig.6 MDA level of L-02 cells exposed to different concentrations of VC and40μg/mL AFB1

由图6可知，与AFB1组相比，VC干预组的MDA含量水平整体降低，且MDA含量随VC质量浓度的增大而逐渐降低，在VC质量浓度为0.1 mg/mL叶出现最低点。

由表4及图6可知，AFB1能使脂质氧化产生MDA，使MDA含量显著升高，而VC干预能有效降低MDA的含量，并且随着VC质量浓度的升高，MDA含量降低的越来越明显。因此，VC能有效减轻由AFB1带来的脂质氧化程度。 2.7 VC干预下AFB1作用于L-02细胞叶的ROS含量

图7 流式双染散点图（7AAD染色及DCFH-DA染色）Fig.7 Flow cytometric scatter plots (7AAD dye and DCFH-DA dye)

通过7AAD染色，细胞处于Q3、Q4区域叶为7AAD强度低的活细胞，Q1、Q2为7AAD强度高的凋亡细胞。因此，Q1为DCFH-DA强度低、7AAD强度高象限，Q2为DCFH-DA强度高、7AAD强度高象限，Q3为DCFH-DA强度低、7AAD强度低象限，Q4为DCFH-DA强度高、7AAD强度低象限。

由图7可知，40 μg/mL AFB1损伤组的细胞在横坐标上相比于空白对照组右移，细胞被DCFH-DA染色较分散，表明有一小部分细胞没被DCFH-DA染色，整体达到DCFH-DA为103的强度，证明ROS含量比空白对照组高，且有一小部分细胞突破7AAD染色103界线，证明AFB1损伤组部分细胞死亡。与40 μg/mL AFB1损伤组相比，0.1 mg/mL VC干预组的细胞整体回归Q3象限，细胞较为集中，证明细胞死亡数较AFB1损伤组减少，而且ROS含量也明显减少，细胞团退回DCFH-DA 103界限以内。这表明VC干预能够减少AFB1对细胞的损伤，减少ROS的产生，有效减少AFB1带来的氧化应激。

空白对照组的大部分细胞集中在Q3象限，表明大多数细胞存活，且ROS含量很低。AFB1损伤组的细胞群集中在Q3和Q4象限间，表明大多数细胞存活，但产生的ROS较空白对照组多。VC干预组与空白对照组相似，大多数细胞处于Q3

象限，表明VC干预可以有效减少由于AFB1产生的ROS。

由图8可知，40 μg/mL AFB1损伤组中细胞的DCFH-DA峰值出现在103，与空白对照组细胞的DCFH-DA峰值出现在102比较明显上升，这说明AFB1能使细胞产生氧化应激，产生大量ROS。0.1 mg/mL VC干预能有效降低细胞内ROS的含量，使DCFH-DA的峰值位移落到102～103区间，证明VC干预能使L-02细胞内ROS的产生量减少，减轻氧化应激损伤。

图8 L-02细胞DCFH-DA染色图Fig.8 Analysis of L-02 cells stained with DCFH-DA

AFB1损伤组ROS的平均荧光强度为635，远高于空白对照组（1）与VC干预组（198）；而相比AFB1损伤组，VC干预组的ROS平均荧光强度显著降低，表明ROS水平显著降低，提示VC可以减轻AFB1产生的氧化损伤。 2.8 VC干预下AFB1对L-02细胞周期的影响

图9 不同组L-02细胞的细胞周期图Fig.9 Cell cycle analysis of L-02 cells from different groups

表5 40μg/mLAFB1和VC单独及联合作用对L-02细胞周期的影响（n=6）Table 5 Effects of40μg/mLAFB1and VC alone and in combination on cell cycle of L-02 cells (n= 6)注：G0.休眠期；G1.DNA合成前期；S.DNA合成期；G2.DNA合成后期；M.细胞期。组别 细胞占比/%G0/G1期 S期 G2/M期空白对照组 63.2±2.5 23.6±2.2 3.2±0.5 40 μg/mL AFB1组 85.6±4.3* 4.5±1.8* 0.9±0.2*0.1 mg/mL VC组 68.9±3.2 19.8±1.2 2.9±0.4 40 μg/mL AFB1＋0.1 mg/mL VC组 73.5±2.3 15.6±1.7 3.5±3.2

本研究采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况，以观察AFB1诱导L-02细胞

DNA双链断裂后是否会导致细胞周期阻滞的发生。由图9及表4可知：与空白对照组相比，40 μg/mL AFB1处理细胞24 h后，G0/G1期细胞比例显著增加，而S期和G2/M期细胞比例显著下降（P＜0.05）；与空白对照组相比，0.1 mg/mL VC处理组细胞的G0/G1期细胞比例增加，S期和G2/M期细胞比例下降，但差异均不显著；与空白对照组相比，0.1 mg/mL VC和40 μg/mL AFB1共同处理的细胞，其S期细胞比例下降，G0/G1期和G2/M期细胞比例上升，但差异均不显著（P＞0.05），说明AFB1诱导L-02细胞在G0/G1期发生了细胞周期阻滞，而添加0.1 mg/mL VC有助于减少细胞阻滞的发生。 2.9 VC干预下AFB1对L-02细胞凋亡率的影响

图10 40μg/mL AFB1和VC单独及联合作用于L-02细胞24 h的细胞凋亡率Fig.10 Flow cytometric analysis of the rate of apoptosis in L-02 cells exposed to40μg/mL AFB1 and VC alone and in combination for 24 h 由图10可知：40 μg/mL AFB1作用后，凋亡细胞主要集中于图中的Q2象限，代表其主要为处于凋亡中晚期的细胞；与空白对照组相比，0.1 mg/mL VC单独作用以及0.1 mg/mL VC联合40 μg/mL AFB1共同作用后的细胞没有显著性差异，凋亡现象没有明显变化。

表6 40μg/mLAFB1及VC作用于L-02细胞24 h的细胞凋亡率Table 6 Rates of apoptosis in L-02 cells exposed to40μg/mLAFB1and VC alone and in combination for 24 h组别 细胞比率/%存活细胞 早期凋亡细胞 中、晚期凋亡及死亡细胞空白对照组 76.9±3.5 0.7±0.2 5.2±4.3 40 μg/mL AFB1组 40.5±1.6* 42.3±2.7* 13.4±4.5*0.1 mg/mL VC组 69.8±2.1 5.4±1.0 10.2±1.2 40 μg/mL AFB1＋0.1 mg/mL VC组 60.1±3.4 13.7±1.9 24.5±4.2

由表6可知：40 μg/mL AFB1处理组细胞的凋亡率与空白对照组相比差异显著

（P＜0.05）；0.1 mg/mL VC处理组和40 μg/mL AFB1＋0.1 mg/mL VC处理组与空白对照组相比差异均不显著（P＜0.05），说明VC对AFB1引起的L-02细胞凋亡具有一定的保护作用。 3 结 论

利用MTT和中性红法初步筛选出AFB1 IC50值范围及VC无细胞毒性范围进行后续实验，根据AFB1的IC50值，选择损伤组暴露质量浓度为40 μg/mL，VC的质量浓度选择在细胞活性最高区域的0.025～0.250 mg/mL进行后续实验，并进一步对VC有效氧化保护浓度进行筛选。利用中性红法测定不同质量浓度VC干预下AFB1对L-02细胞的损伤叶发现，当VC质量浓度≥0.5 mg/mL叶，细胞活性与AFB1损伤组相近，由于VC本身呈酸性，因此并不排除pH值导致的影响，也不排除VC在高浓度下能与AFB1产生协同作用。

以VC处理作为阳性对照，其能够明显降低AFB1组细胞的ROS荧光强度水平；对于L-02细胞，VC处理组及VC＋AFB1处理组细胞的ROS水平较空白对照组高，但较AFB1处理组低；添加VC能够帮助L-02细胞降低胞内MDA水平，拮抗氧化损伤。

通过细胞凋亡及细胞周期检测，发现AFB1造成L-02细胞中晚期凋亡的细胞所占比例较大，添加VC能有效抑制细胞凋亡的发生；在细胞周期的检测中发现，AFB1能够造成L-02细胞发生G0/G1期阻滞；添加VC后，各细胞周期指标与空白对照组接近。

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