新发现：线粒体抑制剂有望靶向K-Ras驱动
的肿瘤
原创2017-07-25 订阅号APExBIO
K-Ras是癌症中最常见的突变致癌基因之一，K-Ras驱动多种恶性肿瘤包括结肠癌、肺癌和胰腺癌等，是癌症治疗的重要靶标。为了更好地了解K-Ras突变体细胞生长的遗传依赖性，作者在两个细胞系等基因对中进行CRISPR筛选，并联合shRNA筛选（靶向必需基因）鉴定突变体K-Ras的合成致死基因。富集分析显示，这些基因的很大一部分在线粒体中起作用，它们的缺失会抑制K-Ras突变细胞的生长。为了验证K-Ras的致死相互作用，作者基于CRISPR基因组工程产生细胞系等基因对，证实了K-Ras突变细胞对这些线粒体途径的依赖性。最后发现，线粒体抑制剂阻碍体内K-Ras突变体肿瘤的生长。该项研究有助于推进K-Ras驱动恶性肿瘤的靶向治疗。
在治疗癌症方面，直接抑制K-Ras是有临床困难的，到目前为止，仍然未研发出成功的靶向治疗。但是研究者们在努力寻找新的策略。有人研究抑制Ras信号传
导的下游分子，特别是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号转导。鉴定致癌K-Ras的合成致死（synthetic lethal）相互作用是阻止K-Ras驱动肿瘤生长的另一种方式。合成致死筛选，涉及两个突变基因的相互作用，其中单独存在的一个突变基因不会对细胞活性产生影响，但两个突变基因的合并会导致细胞死亡。由于这些突变基因仅存在于癌细胞而不存在于正常细胞，因此可以选择性地在已有一个突变基因的癌细胞中模仿另一个突变基因的作用来靶向性杀死癌细胞。合成致死作用最明显的是PARP抑制与BRCA1或BRCA2基因功能缺失的组合，BRCA1或BRCA2基因受损的细胞对PARP抑制剂敏感，导致细胞死亡。
在重现性上，基于CRISPR的筛选优于RNAi筛选，可能是跟小发夹RNA（shRNA）相比，导向RNA（gRNA）具有低脱靶效率。但是CRISPR经常产生无效突变，而不是不完全mRNA耗尽引起的RNAi的次形态效应（hypomorphic effects），因此CRISPR会导致基因功能的显著降低。因此，虽然CRISPR具有优越的属性，但是RNAi在研究必需基因（essential genes）时会产生次形态表型，因此具有优势。
在本研究中，作者联合全基因组CRISPR和shRNA筛选来靶向等基因细胞系中的必需基因组合来鉴定突变体K-Ras增殖所需的途径。
为了找到K-Ras突变细胞生长所必需的基因，作者使用结直肠癌HCT116和DLD1细胞（只有K-Ras突变不同）的等基因对，通过一个全基因组慢病毒CRISPR文库鉴定出优先脱落且其缺失对K-Ras突变体细胞更具有毒性的基因（合成致死基因）。对于DLD1和HCT116细胞系，测定具有高K-Ras合成致死分数的基因，鉴定两个筛选中的高分重叠基因。富集分析显示这些基因涉及蛋白质翻译，RNA加工和剪接以及线粒体基因。在LS513细胞（K-Ras G12D突变型结直肠肿瘤细胞系）中进行了另外的全基因组CRISPR筛选，发现线粒体核糖体基因对于K-Ras突变LS513细胞的存活是必需的。
为了进一步研究这些线粒体基因即K-Ras的合成致死伴侣，进行GO富集分析。结果，富集的途径包括线粒体蛋白翻译，转录和氧化磷酸化。即K-Ras突变体细胞依赖于线粒体途径，包括线粒体翻译。许多抗生素，如四环素及其衍生物，靶向细菌核糖体，通常用于治疗感染。由于细菌和线粒体核糖体共享共同的祖先，这些相同的抗生素可用于抑制人类细胞中的线粒体翻译。这些抑制剂之一是替加环素（Tigecycline）。结果发现K-Ras突变体细胞比对应的野生型（WT）对Tigecycline更敏感。通过使用Tigecycline阻断线粒体翻译，足以减少K-Ras突变细胞的锚定依赖性生长。
为了直接确定任何必需基因的表达减少是否与突变体K-Ras合成致死，作者开发了一种诱导型shRNA文库，鉴定突变型K-Ras的其它合成致死性伴侣。
通过shRNA必需基因文库筛选WT和K-Ras突变体DLD1细胞，发现了许多与致癌K-Ras显示合成致死性的基因。位于首位的合成致死基因之一是TCP1，一部分含有TCP1 / TCP1环络合物（CCT / TRiC）的八聚体伴侣蛋白。使用六个不是用于筛选必需基因文库的shRNAs，来沉默WT1和K-Ras突变体DLD1细胞中TCP1的表达，观察到K-Ras突变细胞特异性增殖的强烈降低。SAMM50（一种参与维持线粒体结构、进入和组装线粒体外膜蛋白的线粒体蛋白质）的缺失也被鉴定为K-Ras合成致死。
接下来，用CRISPR / Cas9介导的等基因对检测K-Ras合成致死性相互作用，作者使用这个等基因对（Cre重组酶表达可以启动内源致癌K-Ras G12C等位基因，即通过控制Cre重组酶的表达精确控制内源突变体K-Ras的表达）验证抑制线粒体翻译或氧化磷酸化是否会导致表达突变型K-Ras细胞的显著减少。分别用腺病毒GFP或Cre处理AALE LSL-K-Ras G12C细胞，并分别测定鱼藤酮（Rotenone，氧化磷酸化抑制剂）或替加环素（Tigecycline，线粒体翻译抑制剂）对增殖的影响。Rotenone处理导致K-Ras突变体特异性增殖减少。类似地，Tigecycline处理导致的K-Ras突变体特异性增殖减少。该第3对等基因细胞系结果支持K-Ras突变细胞对氧化磷酸化和线粒体翻译的依赖性，进一步验证了原始筛选中鉴定的途径。
将CT26细胞（具有KRAS活化突变，并且增殖依赖于突变K-Ras的表达）注入BALB / c小鼠。用VLX-600（抑制线粒体呼吸），Tigecycline或VLX-600和Tigecycline的组合进行处理。Tigecycline与VLX-600的组合在阻止肿瘤生长方面比单独使
用单一药物照组更有效。这些结果表明，靶向线粒体翻译和呼吸可以抑制K-Ras突变细胞的致瘤性生长。
目前还不清楚K-Ras突变体细胞对线粒体翻译的依赖性是否是K-Ras本身直接向线粒体发出信号，但这是一个有趣的可能性。该项研究发现K-Ras驱动的肿瘤对线粒体抑制剂的治疗敏感，包括抗生素如Tigecycline。这些线粒体抑制剂是否像BRAF或MEK抑制剂一样靶向治疗癌症，将需要在未来进行探索。
原始论文：
A Role for Mitochondrial Translation in Promotion of Viability in K-Ras Mutant Cells.
Cell Rep. 2017 Jul 11;20(2):427-438. DOI: 10.1016/j.celrep.2017.06.061
篇外：本文中使用的线粒体翻译抑制剂Tigecycline购于APExBIO（货号A5226）。
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