黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析

微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.41No.3

June2001

黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析

王红宁 吴 琦 刘世贵 谢 晶 马孟根

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(1四川大学生命科学院 成都 6100) (2四川农业大学动物科技学院 雅安 625014)

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摘 要:通过对黑曲霉N25植酸酶phyA基因PCR扩增,获得了一条长约116kb的特异性PCR产物,并进行了酶切鉴定。然后在pUC18质粒中构建了含有目的基因片段的克隆质粒pFNP-1。DNA序列测定表明,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列,phyA基因全长1506bp,其中包含一段长102bp的内含子,编码467个氨基酸,5.端有一段编码19个氨基酸的信号肽序列。黑曲霉N25与产植酸酶酶活最高的天然黑曲霉标准菌株NRRL3135的植酸酶phyA基因(GenBankAccession:M94550)相比较,其同源性为961746%,编码的氨基酸序列同源性为971%。将黑曲霉N25植酸酶phyA基因序列及其相应的氨基酸序列在国际基因库中注册(注册号分别为:AF218813,AAF2548111),此基因是目前中国在国际基因库中注册的第一个植酸酶phyA基因。

关键词:黑曲霉,植酸酶,phyA基因,PCR,序列分析

中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2001)03-0310-05

猪、禽饲料主要来源的玉米、豆饼粕、谷糠、棉籽饼粕所含的磷约40%~70%以植酸磷的形式存在。猪、禽等单胃动物,消化道内缺乏能分解消化植酸磷的酶,仅能利用玉米中磷的10%~20%、豆饼中磷的25%~35%,典型猪日粮中磷的利用率只有15%,其余85%左右的磷从粪便中排出

[3]

[1,2]

。一些国家从环保的角度对集约化畜牧场已提出了

排磷的要求。此外,植酸盐通过螯合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾等主要微量元素的利用率;通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对蛋白质的消化吸收率,从而使整个饲料的利用率降低

[4]

[1~3]

。

植酸酶(Phytase)是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。大量研究表明,在猪、禽日粮中添加植酸酶,可使饲料中磷的利用率提高40%~60%,粪便中磷的排出量减少30%~50%等

[8~9]

[5~7]

。通过植酸酶菌株筛选,特别是通过植酸酶

基因工程菌的研究,提高植酸酶的产量,降低生产及应用成本,已成为研究热点。姚兵

进行了黑曲霉963植酸酶phyA2基因的序列测定和在毕赤酵母中的表达研究。本试验拟对从我国自行分离、筛选出的植酸酶高产黑曲霉菌株N25,进行植酸酶phyA基因的PCR扩增,phyA植酸酶基因的克隆和序列测定,为黑曲霉N25植酸酶phyA基因高

效表达载体的构建,最终降低植酸酶的生产成本提供基础材料和科学依据。

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/九五0国家重点科技攻关项目(96-009-02-06)

作者简介:王红宁(1963-),女,四川省西昌市人,四川农业大学教授,动物传染病与预防兽医学、微生物学专业硕士研究生导师,主要从事现代遗传与生物工程研究。收稿日期:2000-08-14,修回日期:2000-10-20

3期王红宁等:黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析311

1 材料和方法

1.1 试验菌株

黑曲霉(Aspergillusniger)N25为我国自行分离鉴定的产植酸酶菌株。112 黑曲霉细胞总DNA的提取

将黑曲霉N25孢子接种于马铃薯培养基中,28e培养,待完全产孢后,用无菌012%吐温-80溶液制成孢子悬液。将孢子悬液接种到200mL的玉米浸提液培养基内,28e水浴180rPmin摇振培养18~24h,收集菌丝体,按Ehrlich等DNA。

[10]

的方法提取黑曲霉细胞总

113 黑曲霉植酸酶phyA基因的PCR扩增及其产物的酶切分析

11311 引物设计:根据从基因库下载的多条黑曲霉植酸酶phyA基因序列(Accession:M94550,L02421,A19451,Z114,A19452),结合已报道的黑曲霉植酸酶phyA基因PCR引物,用OLIGO软件设计、分析、筛选出下列1对24mer引物,与模板配对均有16个碱基,且与phyA基因有部分重合,在上下游引物中引入EcoRÑ和KpnÑ酶切位点。

上游引物)))P15.CGGAATTCTCTCATAGGCATCATG3.;

下游引物)))P25.CTGGTACCGTARTTCAGCTAAGCA3.。

11312 植酸酶phyA基因的PCR扩增:黑曲霉细胞总DNA模板750mg,MgCl2终浓度为215mmolPL,dNTPmixture终浓度各为0125mmolPL,上、下游引物终浓度各为014LmolPL,Taq酶410U,反应总体积100LL。PCR反应参数:94e预变性7min,然后进入循环:94e变性1min,55e复性1min,72e延伸115min,经过35个循环后,在72e延伸10min结束反应。11313 植酸酶phyA基因PCR扩增产物的酶切分析:根据对基因库下载的黑曲霉植酸酶phyA基因序列的酶切位点分析,phyA基因含有BamHÑSacI、SalI等性内切酶的单一酶切位点,不含有HindÓ、XbaÑ、KpnÑ、PstÑ等性内切酶的酶切位点,用这些性内切酶对经纯化后的PCR扩增产物进行酶切图谱分析。

114 phyA基因PCR产物的克隆

采用DNA纯化试剂盒进行目的DNA片段(植酸酶phyA基因PCR产物)的纯化,采用碱法抽提pUC18质粒DNA。将纯化的DNA和pUC18质粒DNA分别用EcoRÑ和KpnÑ进行双酶切。按5分子克隆实验指南6采用氯化钙法制备大肠杆菌JM109感受态细胞,进行连接反应、转化、阳性克隆菌株的筛选及电泳鉴定。115 克隆片段的DNA序列测定

阳性克隆菌株质粒DNA由宝生生物工程(大连)有限公司进行克隆片段的DNA序列测定,并对测序结果进行分析。

[11]

2 结果和讨论

211 phyA基因PCR扩增及其产物的酶切

酶切结果见图1。从图1可以看出,在此PCR反应条件下,获得了一条长约116kb的特异性PCR扩增条带,符合phyA基因的理论长度。扩增片段不被HindÓ、XbaÑ和PstÑ所酶切,而被BamHÑ酶切为约700bp和900bp的两个片段、被SacÑ酶切为约500bp和

312微 生 物 学 报41卷

1100bp的两个片段、被SalÑ酶切为约600bp和1000bp的两个片段。此结果与已知的黑曲霉植酸酶phyA基因的酶切图谱基本一致,结合PCR产物的特异性,初步判断此PCR产物含有phyA基因。

212 植酸酶phyA基因PCR产物的克隆

在含有X-gal和Amp的培养基上,挑取白色菌落,获得含有阳性克隆质粒的菌株pFNP-1。经电泳检测,阳性克隆质粒DNA比pUC18质粒DNA长约116kb。

图1 植酸酶phyA基因PCR扩增及其产物

的酶切分析

Fig.1 EnzymedigestionofthePCRproductof

phytasephyA

11200bpDNAladder;2.PCRproduct;3.PCRproductPHindÓ;41PCRprodluctPxbaÑ;51PCRproductPPstÑ;61PCRproductPSalÑ;71PCRproductPSalÑ;81PCR

productPBamHI.

213 克隆片段的DNA序列测定及分析

测序结果表明:PCR产物全长1562bp,其中包含1506bp植酸酶phyA基因全序列,GenBank

注册号为AF218813,蛋白质编号为AAF25481(图2)。从图2可以看出,PCR扩增产物中的黑曲霉N25植酸酶phyA基因全序列,其结构基因

全长1506bp,其中+45bp~+146bp的102个核

[12]

苷酸序列是一典型的真菌内含子序列,基因含有真菌内含子的特征保守序列:供体序列(Donor))GTATGC、套索序列(Lariat))GCTGAC及受体序列(Acceptor))CAG。黑曲霉N25phyA基因中的G+C含量较高,达到52%,而密码子第三位碱基的G+C含量更高达6217%。在密码子第三位碱基上高频使用G和C碱基是曲霉中高效表达蛋白编码序列所具有的特征之一

[13]

。从上图可以看出,黑曲霉N25phyA基因相应的氨基酸序列共有467

[14]

个氨基酸,其中,根据VonHeijne的信号肽切割位点的预测原则并结合已知的植酸酶氨

基酸序列分析,信号肽切割位点位于第19个氨基酸残基之后,其余的448个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。从氨基酸序列上还找到了植酸酶的活性位点序列(Active-sitesequence)

[4]

:CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK,它位于氨基酸序列的+71~+93。其中

RHGARYPT是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列。

与目前报道的产植酸酶酶活最高的天然黑曲霉标准株NRRL3135(来源于Aspergillusniger(ficuum)var.awamori)的phyA基因(GenBankAccession:M94550)的序列比较,二者在结构基因的长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、内含子序列及其位置等均相同,在DNA序列上仅有49个位置上的碱基不相同,同源性达到96175%(1457P1506)。二者植酸酶phyA基因相应的氨基酸序列,在氨基酸残基个数、信号肽及其位置、植酸酸活性位点序列及其位置均完全相同,仅有11个氨基酸残基不同,同源性高达971%(456P467)。来源于黑曲霉的植酸酶phyA是一种糖基化蛋白,Yanming等的研究表明,糖基化对表达的phyA的生物合成和热稳定性至关重要。在黑曲霉N25phyA基因编码的氨基酸序列上,发现了10个潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-SerPThr,X为任意氨基酸),与黑曲霉NRRL3135株phyA基因编码的氨基酸序列上的N-糖基化位点个数的位置完全相同。[15,16]

3期王红宁等:黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析313

图2 黑曲霉N25植酸酶phyA基因DNA序列及推导出的氨基酸序列

Fig.2 TheDNAsequenceofphyAanddeducedaminoacidsequenceofA.nigerN25strain

Note:Theintronisindicatedbylower-caseletters;Signalpeptidecleavagesiteisindicatedbyarrow;Theactive-siteaminoacidssequenceisunderlined;PotentialN-glycosylationsitesareindicatedbyaminoacidsNunderlineddoubly.

由此可见,黑曲霉N25黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因具有高度同源性,且该菌株是作者分离的100多株丝状真菌中产植酸酶酶活最高的黑曲霉菌株,可作为进一步构建植酸酶phyA基因表达载体的材料。现已构建成phyA基因的pPICqk表达载体,并在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达,详细内容将另文报道。

314微 生 物 学 报41卷

参

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CLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFTHEPHYTASE

PHYAGENEOFASPERGILLUSNIGERN25

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WangHongning WuQi LiuShigui XieJing MaMenggen

(1CollegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu,6100China)

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(2CollegeofAnimalTechnologyandScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya.an625014,China)

Abstract:ThephyAencodingphytaseofAspergillusnigerN25wasamplifiedbythepolymerasechainreaction(PCR)withprimersdesignedaccordingtothesequencesofthephyAinGenBank.Theamplifiedfragmentwasclonedandsequenced.Theresultsshowthat:thecodingregionis1506bpinsize,includesa102bpintron,andencodesapeptideof476aminoacidresidues,inwhichthereisasignalpeptidewith19aminoacidsandamaturepeptideof448aminoacids.ComparisonofthissequencewiththephyAofthenaturalA.nigerNRRL3135(GenBankAccession:M94550),themosthighlysecreting-phytasestrain,showsthatthenucleotidehomologyisashighas96.746%,andtheaminoacidhomologycomesupto97.%.ThephyAofA.nigerN25straininthispaperisappropriatetobeusedtoconstructthephytasegene-engineeringbacteria.ThephyAanditsaminoacidsequencehavebeenaccessedbyGenBank(Accession:AF218813,AAF25481.1).Keywords:Aspergillusniger,,Phytase,phyA,PCR,Sequenceanalysis

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ProjectofChineseNationalProgramsforScienceandTechnologyDevelopment(96-009-02-06)