纯及其菌落形态观察
底泥中的细菌数量和抗Cu的细菌分离提
2013年10月
底泥中的细菌数量和抗Cu的细菌分离
提纯及其菌落形态观察
一、 实验目的
1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的方法。
2、了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。 3、学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。
4、从污泥中分离、纯化和培养微生物，掌握常用的分离和纯化微生物的方法。 5、学会几种接种技术。
6、观察分离出来的几种细菌相应的菌落形态特征。
7、通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。 9、学会细菌菌落总数的测定。 二、实验原理 1、培养基原理
培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度15-20g∕L的琼脂为固体培养基，加入质量浓度为3-5g/L的琼脂为半固体培养基。 2、灭菌原理
本次实验采取加压蒸汽灭菌法。加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。包括干热空气灭菌和火焰灼烧灭菌等以干热方法杀死细菌达到灭菌的目的。 3、分离纯化原理
在自然界和污水生物处理中，细菌和其他微生物杂居在一起。为了获得纯种
就必须从混杂的微生物群体中分离出来。本实验使用的平板划线法和浇注平板法。平板划线法是指把混杂在一起的微生物不同种的不同个体或同一种的不同细胞，通过带菌的接种环在培养基表面做多次划线的稀释法，能得到较多的分布的单个细胞，经培养后即成单菌落，通常把这种菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可以得到细胞菌落的克隆纯种。浇注平板法是将菌液和培养基混合后培养出单菌落，此方法也常用于细菌菌落总数的测定。 4、微生物的接种原理
接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。本次实验采取斜面接种和穿刺接种，使用到的接种工具是接种环和接种针。其中，接种环一般用电炉丝或者镍丝，环的柄为金属材质，其后端套上绝热材料套。 5、菌落形态观察原理
由于微生物个体表面结构、方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可从菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬、表面光滑粗糙等情况，初步辨别是何种类型的微生物。 6、细菌菌落总数测定原理
细菌种类很多，有各自的生理特性。必须用适合它们生长的培养基才能将它们培养出来。然而，在实际中不容易做到。所以通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程度。污泥中细菌总数与污泥受到有机物污染的程度成正相关。细菌总数越大，说明污泥被污染的越严重。
三、实验器材及试剂 1.培养基的配置和灭菌
（1）仪器：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、酒精灯、稀释水、刻度移液管、培养皿、
试管、500mL和250mL锥形瓶、烧杯（大、小各一个）、500mL和100mL量筒各一个、滴管2个、镊子、药物天平、移液（头）、
玻璃棒2支、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、接种环、恒温培养箱、表面皿、锡纸、记号笔、三角刮刀、PH试纸和棉花等；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。
（2）试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂、重金属离子试剂（5mg/LCu
离子试剂）、95%酒精等。
2、分离纯化 （1）样品：底泥
（2）仪器：在培养基的配置和灭菌过程准备的无菌物品，包括各种玻璃器皿、培养基、
稀释水等。以及接种环、酒精灯、恒温培养箱等。
3、菌落形态的观察
（1）仪器：恒温培养箱、酒精灯、载玻片、接种环等。
（2）材料：4大类菌落（培养皿）：从污泥中分离培养出来的各种细菌，另外实验室配给
放线菌、酵母菌及霉菌等各类菌落。
四、实验步骤 1. 玻璃器皿的准备 （1）洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。 （2）包装
A. 移液（头、盒）的包装 移液管的吸端用细铁丝（或牙签）将少许棉
花塞入构成1-1.5cm长的棉塞，起过滤作用（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内）。棉塞要塞的松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。然后将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结，待灭菌。
B. 培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将16套培养
皿（皿底朝里，皿盖朝外，8套、8套相对而放）包好。
C. 棉胶塞的制作：按按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中间厚、
周围逐渐变薄的近正方形，折一个角（成五边形）卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为宜。棉塞四周应贴紧管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约3/5塞入管内。必须做到 松紧适宜、紧贴管壁，拔出时不松散、不变形。 D. 试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包裹并用细绳或橡皮筋扎好，放在铜丝
篓内带灭菌。
E. 培养皿灭菌方法： 先将已包装好的物品放在电热干燥箱中，将温度调至
160℃后维持2h，结束是把干燥箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，将物品取出。此过程中应注意温度的变化，不得超过170℃，避免包装纸烧焦和其他不安全情况。灭好菌的器皿应保存完好，否则易染菌。 2. 培养基的配制 （1）配制培养基
①无Cu2+培养基（300mL）：往500mL干净的烧杯中加入牛肉膏1.5g，蛋白胨
4g，NaCl 1.5g，蒸馏水300mL，让各成分充分溶解，然后向一定容量锥形瓶中加入8g琼脂粉待用。
②无Cu2+半固体培养基（200mL）：往500mL干净的烧杯中加入牛肉膏1g，蛋白胨2g，NaCl 1g，蒸馏水200mL，让各成分充分溶解。然后向一定容量锥形瓶中加入1g琼脂粉待用。
③含Cu2+培养基（100mL）：往100mL干净的烧杯中加入牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL，让各成分充分溶解。然后向一定容量锥形瓶中加入400μL 0.2mg/L Cu2+ 溶液，3g琼脂粉待用。
（注：蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。） （2）调节pH
一般刚配好的培养基是偏酸性的，故要用质量浓度为100g∕L NaOH调pH至7.2-7.4.应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时用pH试纸测试。调整至所需的pH。
（3）分装
A. 分装锥形瓶：培养基分装量一般以不超过锥形瓶总容量的3/5为宜，若分装
量过多，灭菌时培养基容易沾污棉花而导致染菌。
B. 分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，右手
控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装量不超过试管高度（15mm*150mm）的1∕5。分装时谨防培养基沾在管口上，否则会使棉塞沾上培养基而造成染菌。
C. 加锡纸和报纸、包装后灭菌。灭菌条件：121摄氏度（相对蒸汽压力
0.103MPa），15~20min。 3. 稀释水的制备
（1） 锥形瓶稀释水的制备
取一个250ml的锥形瓶装90ml蒸馏水，放约30颗玻璃珠于锥形瓶内，塞上棉塞，包扎后灭菌。 （2） 试管稀释水的制备
另取5支18 mm×180mm的试管，分别装9 mL蒸馏水，塞上棉塞，包扎后灭菌。 4. 灭菌
（1）向灭菌器内加入清洁软水（蒸馏水更好）：水位应不超过水位线标志，以免水进入灭菌桶内，浸湿被灭菌物品。
（2）堆放物品并注意留有空隙：将需要灭菌的物品包好后，顺序放在灭菌桶内的筛板上。
（3）盖上盖子：对称地坚固螺栓，注意不宜旋得太紧，以免损坏橡胶密封垫圈。 （4）打开电源置灭菌温度：通过压力-温度控制器旋钮预置，温度预置范围在120℃左右，时间控制在20分钟，顺时针方向旋转旋钮，灭菌温度预置值减小；反之，预置值增大。 可根据需要确定预置灭菌温度。
（5）设置灭菌时间：按照不同的需要，将计时器旋钮按顺时针方向旋至所需的时间刻度上，当达到预置的灭菌温度时，计时指示灯亮，计时器自动计时。 （6）加热，排放冷空气。 （7）灭菌。
（8）结束（关电源）：此时切忌立即放气，一定要待指针接近“零”位时，再打开放所阀，取出物品，排掉锅内剩余水。
灭过菌的培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或者阴凉处保存备用。 5倒平板 （1）准备
制作前将操作台擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上，用75%酒精擦手。 （2）平板、斜面和半固体培养基的制作
A. 倒平板：将已融化并冷却至50摄氏度左右的培养基倒入培养皿（约10~15ml/
皿），以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，冷凝后即成平板。含Cu2+溶液的培养基4套，无Cu2+溶液的培养基12套。
B. 斜面：将已融化并冷却至50摄氏度左右的培养基用灭菌后的移液量取5mL
培养基，塞上棉胶塞，用一小棉块垫着试管口一端（斜面高度不超过试管总高度的1/2～1/3），冷却后即成斜面。
C. 半固体培养基：半固体培养液冷却至50℃至60℃后，用移液用移液吸取5mL于 5支试管中，用胶塞塞好后，将试管竖直放在是管家中冷却。 （3）检查：将所有培养基放在恒温培养箱中37℃恒温保存24h，检查是否灭菌干净。 6样品采集
取表层河涌底泥样品30g于50mL的烧杯中，在无菌操作台内用100mL量筒量取90mL蒸馏水将烧杯中的底泥全部冲洗进250mL锥形瓶中，再向锥形瓶中加入几滴玻璃珠，然后用锡纸和牛皮纸封口后放摇床150r/min振荡10min。 7稀释样品
将1瓶90ml和5管（根据预备实验数据变化）9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。用1mL无菌移液管吸取1mL10-1浓度菌液于9mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀，即为10-2浓度菌液。同法依次稀释到10-6。 8平板涂布
根据预实验选取10-4、10-5、10-6进行涂布，每个浓度用无菌移液吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀。无铜每个浓度涂2套，含铜涂4套，1套空白。注：开培养基时先用酒精灯烧灼平板培养基外沿，三角刮刀每次用完要烧灼杀菌。
培养：送恒温培养箱培养（正置），如果培养时间较长，中间把培养皿倒置继续培养。 9数菌落 （1）观察步骤：
①将自己培养的细菌菌落逐个辨认并编号，按号码顺序将各细菌的菌落特征描述、记录； ②绘菌落形态图。
（2）细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落特征的比较：对实验培养出来的细菌和实验配给的放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征仔细观察，并将上述4种微生物菌落进行比较，做详细记录。
主要特征 菌落主要特征 细菌 酵母菌 放线菌 干燥或较干燥，小而紧密 霉菌 干燥，大而疏松或大而紧密 不透明 湿润或较湿润，少数较湿润，大而突干燥，小而突起或大而平坦 起，菌苔较厚 菌落透明度 菌落与培养基结合程度 菌落颜色 透明、半透明或不透明 结合不紧 稍透明 不透明 结合不紧 牢固结合 较牢固结合 颜色多样 颜色单调，多为乳白色，少数红色 颜色多样 颜色多样，且鲜艳 菌落正反面颜色的差别
基本不同 基本相同 一般不同 一般不同 10纯种分离纯化平板划线法
从前面已培养出菌落的培养基中挑选两个长势较好的菌落，用接种环沾取细菌，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜（打开培养皿前先在酒精灯旁烧一圈），左手拇指和右手食指将皿盖掀半开右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿划破培养基）。划线完毕盖好皿盖，重复制作4个含铜培养基和4个不含铜培养基，一套不含铜的空白培养基。
11斜面接种
右手拿接种针，在火焰上将环烧红以达到灭菌的目的，冷却后取种，然后让平板菌种在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉，用右手小指、无名指和手掌夹住硅胶塞将其拔出。自距斜面底部2mm开始向上做“Z”形致密划线直至距斜面顶端2mm，抽出接种针，试管过后塞上硅胶塞，将试管放回试管架。灼烧接种针，杀灭环上细菌，冷却。
12穿刺接种
将烧过的接种针沾取前面挑选的菌落（接种环已冷却），直接刺入半固体的直立柱培养基，并按原路抽出，将试管放回试管架。灼烧接种针，杀灭环上细菌。重复制作4个斜面和一个空白对照。
培养：将做好的平板、斜面和试管送至培养箱（37℃）培养，待看结果。
13现象与数据记录 1.河涌底泥中细菌总数 A.细菌总数的菌落计数方法
进行平皿菌落计数是，可用肉眼观察，也可借助放大镜和菌落计数器计数。
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该河涌底泥样品的细菌总数（见下表）。
（3）若有两个稀释度，其平均菌落数在30—300之间，则应按两者菌落数以各自稀释倍数后的总数之比（稀释度高的数/稀释度低的数）来决定。若其值小于2，应报告两个总数的平均数（若大于等于2则报告其中较少的菌落总数）。 （4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。
（7）若所以稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 （8）菌落计数的报告：菌落计数在100以内按实际数报告，大于100，采用二位数计数，在二位数有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩减数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。在报告菌落数为“多不可计”时，应注明河涌底泥样品的稀释倍数。
1菌落总数记录结果 稀释度 平板 菌落数 平均菌落数 计算方法 10-4 1 27 22 2 16 10-5 1 7 10 2 13 10-6 1 0 1 2 1 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 细菌总数/ml 2菌落形态记录表
22×104 编号 主要特菌落主菌落透菌落与培养菌落菌落正反面颜征 1 要特征 明度 不透明 基结合程度 紧 颜色 奶黄色 色的差别 无差别 菌落大 干燥，边缘规则，无突起 2 菌落小 湿润，边缘规则，无突起 不透明 紧 白色 无差别 3 菌落小 干燥，边缘规则，有突起 不透明 紧 奶黄色 无差别 4 菌落小 湿润，边缘规则，有突起 微透明 紧 白色 无差别
3提纯培养结果 （1）平板划线 组别 空白组 含Cu离子组 没有菌落出现 没有菌落出现 菌1.1：表面干燥，白色（有点黄） 菌落特征 不含Cu离子组 菌1.2：表面湿润，圆形，边缘规则 菌2.1：表面干燥，白色 菌2.2：表面干燥，边缘呈丝状辐射，不齐整 总体：菌落分离比较好
（2）斜面
空白组：没有菌落出现
其余四个斜面的菌落全部聚集在斜面上端
（3）半固体培养基 组别 空白组 不含Cu培养基 没有菌落出现 菌1.1：有菌斑，主要在表面生长，为好氧型细菌 菌1.2：有菌斑，主要在表面生长，为好氧型细菌 菌2.1：表面有菌斑，呈直线辐射状生长，底部有浑浊，为厌氧型细菌，沿线向四周分布，有鞭毛能运动 菌2.2：表面有菌斑，呈直线辐射状生长，底部有浑浊，为厌氧型细菌，沿线向四周分布，有鞭毛能运动 菌落特征
