2011级繁殖实验指导

一、目的和要求

1．熟悉人工授精所用的采精和输精器材,了解其用途及使用方法。 2．练习假阴道的安装方法。 二、材料和仪器设备

1．采精器材：各种公畜采精用假阴道，猪手握法采精用的橡胶手套等。 2．输精器材：牛用、猪用输精器、阴道开张器。

3．辅助器材及药品：高压灭菌器、酒精灯、长柄钳、长镊子、玻璃棒、棒状温度计、灭菌凡士林、70％和95％酒精棉球、橡皮筋、充气泵、电炉、打烧杯、石棉网、50ml注射器等。 三、方法和步骤

先由老师讲解人工授精器材的构造、各部名称和用途，并作假阴道安装的示范。然后学生分组观察并作假阴道的安装练习。 （一）人工授精器材的认识：

1．假阴道：未长筒状，由外壳、内胎和集精杯（管）三个主要部分组成。其粗、细和长、短因畜种而异。不同国家不同时期的设计形式也不尽一致，目前我国常用的有美、苏和日等形式。

外壳：牛、羊和猪的假阴道外壳一般为硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部装有可吹气、注水和排水的开关。猪用假阴道则在此处连接一个可向假阴道内打气的双链球，以调节压力。

马的假阴道的外壳由镀锌铁皮或金属制成。分头、颈和体三部分。筒体的中部装有把柄，其侧面有吹气和注、排水孔，并有封闭塞或橡胶带。

内胎：由优质橡胶制成的胶筒，目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激，利于采精。

集精杯（管）：牛、羊用双层的棕色集精杯（苏式）或有刻度的离心管（美式）。马用黑色橡皮杯（苏式）。猪用棕色有刻度的广口瓶。当用手握法对公猪进行采精时，只需备一只乳胶手套和收集精液的容器即可。

集精杯（管）可借橡皮圈直接固定于假阴道的一端或借橡胶漏斗与假阴道连接。

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2．输精器：

苏式牛、羊输精器为一长颈玻璃注射器。目前常用的为金属或塑料制成的输精管，其后连接一个橡皮球。冷冻细管精液输精则使用特制的卡苏或输精器。 对一些家畜的输精需借助阴道开张器和额灯或手电筒照明进行。开张器的种类和大小因畜种而异。 （二）假阴道的准备要点： 1．假阴道外壳及内胎的检查

（1）检查假阴道外壳两端是否光滑，外壳有否裂隙或开焊之处（特别时马用外壳）。

（2）检查内胎是否漏水。可将内胎注满水，用两手握紧两端，并扭转内胎施以压力，观察胎壁有无破损漏水之处，如发现应及时修补或更换。公猪的手握法采精用的乳胶手套在用前也应检查。 2．采精器材的清洗：

（1）外壳、内胎、集精杯（管）等用具用后可用热的洗衣粉水清洗。内胎的油污必须洗净。

（2）以清水冲净洗衣粉，待自然干燥后即可使用。 3．内胎的安装：

将内胎放入外壳，内胎露出外壳两端大部分长短应相等。而后将其翻转在外壳上，内胎应平整，不应扭曲，再以橡皮圈加以固定。 4．消毒：

先以长柄钳夹取75%的酒精棉球擦拭内胎和集精杯，再以95%的酒精棉球充分擦拭。采精前，最好用稀释液冲洗1～2次。 5．集精杯（管）的安装：

牛、羊、猪的集精杯（管）可借助特制的保定套或橡皮漏斗与假阴道连接。 6．注水：

通过注水孔向假阴道内、外壁之间注入50～55℃温水，使其能在采精时保持38～42℃，注水总量约为内、外壁间容积的1/3～1/2。 7．涂润滑剂：

用消毒好的玻璃棒，取灭菌凡士林少许，均匀的涂于内胎的表面，涂抹深度

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为假阴道长度的1/2左右，润滑剂不宜过多、过厚，以免混入精液，降低精液品质。当用手握法给公猪采精时不须使用润滑剂。 8．调节假阴道内腔的压力：

从注气孔吹入或打入（猪）空气，根据不同家畜和个体的要求调整内腔压力。 9．假阴道内腔温度的测量：

把消毒的温度计插入假阴道内腔，待温度不变时再读数，一般40℃左右为宜，马可稍高，也要根据不同个体的要求，作适当调整。

10．用一块褶成四折的消毒纱布盖住假阴道入口，以防灰尘落入，即可准备采精。

(三) 输精器材的准备

金属和玻璃制成的输精管、输精，最好用高压蒸汽消毒，在输精前最好将输精管用稀释液冲洗1～2次。

细管冷冻精液的输精器一般由金属外壳和里面的推杆组成。使用前金属外套应进行消毒，前端的金属套不能连续使用。使用时将细管的一端剪去，另一端插在输精的推杆上。借助推杆，推动细管中的活塞即可将精液推出。

若采用开张器法输精，需对开张器先进行严格消毒方可使用。 四、作业

指出各种公畜采精器材的异同及优缺点，试提出改进意见。

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实验二 精液稀释液的配制，精液的稀释与液态精液的保存

一、目的要求

掌握精液的不同保存方法、不同畜种精液稀释液配制的一般程序，精液稀释的方法，液态精液的保存方法。 二、实验用品材料

250ml三角瓶、250ml烧杯、100ml量筒、感量为0.1克的天平或电子天平、玻璃漏斗、电炉、石棉网、玻璃棒、定性滤纸、消毒纸巾、秤量纸、灭菌牛皮纸、橡皮筋、10ml一次性注射器、1ml注射器、鲜牛奶、鸡蛋、蒸馏水、75%酒精棉球、葡萄糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素、滤菌器（0.22um）高压灭菌锅、洗瓶，药匙。 三、实验内容

（一）稀释液的配制

各种家畜的精液稀释液的配制方法基本相同，一般都有基础液—加卵黄的稀释—加甘油等防冻剂的稀释。由于目的不同，可能只有一个环节，也可能为二或三个环节。

1、牛的冷冻精液稀释液的配制——蔗-卵-甘液 配方： 基础液 蔗糖 双蒸馏水 基础液 低温保存稀释液 卵黄 青霉素 链霉素 冷冻精液稀释液 低温保存稀释液 甘油 12g 100ml 80ml 20ml 120mg 100mg 43ml 7ml 共50ml 共100ml 共100ml （1）玻璃用品的清洗与消毒：将所有玻璃用品用洗涤剂洗净，用稀盐酸浸泡并用自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗四遍，空干水分，用纸将瓶口包好，放入120℃干燥箱中干燥1h，放凉备用。如果采用滤菌器过滤，应将滤菌器清洗用蒸馏水冲净，把滤膜固定在滤菌器内，用注射器测试是否安装周正：注射器与滤

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菌器进口相连，当加压后，感觉有压力，当释放后，活塞回到原位。然后将滤菌器用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中高压灭菌。

（2）天平的标准：用两张圆形硫酸纸放在天平的左右托盘上，校准天平。 （3）称量药品：称取配方需要量的药品，并放入大烧杯中。牛蔗-卵-甘液，基础液为12%蔗糖，准确称量分析纯蔗糖12克放入大烧杯中。

（4）溶液配制：用量筒量取双蒸水100ml，加入烧杯中，用磁力搅拌器或玻璃棒搅拌使其溶解。

（5）用一层定性滤纸过滤溶液至三角瓶中。

（6）在三角瓶上加牛皮纸盖并橡皮筋固定，放在盖有石棉网的电炉上加热至沸腾，迅速将其取下，放凉。制成基础液。基础液如果不马上使用可放入在2～5℃冰箱中备用，保存时间不超过12h。

（7）取卵黄液：新鲜鸡蛋用75%的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用四层对折（8层）的消毒纸巾上。小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附。最好用称量的方法将一定量的卵黄加入基础液中。也可用去掉针头的一次性注射器吸取一定体积的卵黄液加入基础液中。如果用量筒取卵黄不能保证加入卵黄体积的准确性，因为卵黄的粘度很大，不易倒净。

（8）卵黄液与基础液的混合：取80ml放凉的基础液，加入三角瓶中，并放天子秤上，除皮后，将卵黄移至纸巾的边缘，用针头将卵黄膜挑一小口，使卵黄流入三角瓶中，直到重量达到20克（卵黄的比重与水十分接近，故卵黄体积约为20ml）。

（9）加入抗生素：用煮沸消毒法配制基础液的，应加入抗生素，用电子天平或天平称取0.12克的青霉素和0.1克的链霉素加入基础稀释液与卵黄的混合液中，摇匀。

（10）第二液的制作：用量筒量取第一液43ml加入三角瓶中，放在电子天平上，除皮，加入甘油8.2g（相当于7ml甘油）。如果没有电子天平，可用注射器吸取7ml甘油，不可用量筒量取甘油，因甘油的黏度很大，不容易从量筒中倒出。

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2、猪的低温保存稀释液的配制 配方：

无水葡萄糖 二水柠檬酸钠 基础液 牛奶 双蒸馏水 基础液 低温保存稀释液 青霉素 链霉素 75mL 25ml 100ml 120mg 100mg 共100ml 0.5g 0.39g 共100ml 猪的低温保存稀释液的配制过程中，要注意：

（1）用天平分别秤取0.5g无水葡萄糖和0.39g二水柠檬酸钠溶于25mL蒸馏水中。药品用天平准确称量后，放人烧杯中，加入蒸馏水溶解后，用三连漏斗过滤，用三角烧瓶承接滤液，放入水浴锅内，水浴消毒10-20min。

（2）将新鲜牛奶用2～3层纱布滤入消毒过的烧杯，然后加盖隔水煮沸消毒10min，取出冷却。

（3）待牛奶冷却后，用消毒过的玻棒将奶皮去掉。 （4）取75mL牛乳加入25mL蒸馏水中混合均匀即成基础液。 （5）抗生素用一定量的蒸馏水溶解，在稀释液冷却后加入。 其它方法与牛的低温保存稀释液配制方法完全相同。 3、猪的常温保存稀释液 配方： 无水葡萄糖 二水柠檬酸钠 乙二胺酸四乙酸二钠 青霉素 链霉素 双蒸馏水 50g 3g 1g 0.6g 1g 1000ml 猪的常温保存稀释配制比较简单，由于总量较大，不便于进行过滤，考虑到使用方便，一般将商品稀释粉直接溶解后使用，不经过消毒过程。由于溶解的溶

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质量较大，所以，需要借助于磁力搅拌器，加速溶解。

（二）精液的稀释

选用与精液种类相应的稀释液，把精液的稀释液分别装入烧杯或三角烧瓶中，置于30℃的水浴锅中，用玻璃棒引流，把稀释液沿着器壁徐徐加入到精液中，边加入边搅拌。稀释结束后，镜检精子活力。

1、牛冷冻精液的稀释

根据冷冻精液稀释倍数计算公式：

原精液精子密度解冻后预测活力稀释后每份精液的体积稀释倍数稀释后每份精液中所含的有效精子数 如果总稀释倍数为8倍，则第一次稀释为4倍（即1份原精液，3份稀释液），测出采集的精液的体积或重量，将装精液的三角瓶放入30℃的水浴锅中，然后取精液量3倍的第一液（即低温保存稀释液）加入三角瓶中，放入同一水浴锅中。5分钟后，将第一液沿三角瓶壁缓慢加入原精液中，轻轻摇动混匀。5分钟后，取15ul在37℃温度下检查活力，活力应与稀释前相同。说明稀释液和稀释过程正常。用纱布包4层装入塑料袋中，与第二液一起放入2～4℃冰箱中降温，或放入加有冰块的大口保温杯中。1小时后，将用低温稀释液稀释过的精液与第二液1:1稀释，并放入冰箱或保温杯中，继续保持温度平衡2小时。再检查活力，活力应与原精液接近。

2、猪精液的稀释：

先将稀释液放入水浴锅中升温至35℃，并将一大烧杯放入水浴中升温，然后进行精液采集。采精时，集精杯一般套有一层塑料袋，精液实际上装在塑料袋内。精液送入实验室后，先将大烧杯放在电子秤上，除皮后，将装精液的塑料袋放入大烧杯中，称出精液的重量，测定精子活力合格后，测定精液的密度。根据精子密度，精液总量，计算出可分装的份数，然后乘以每份稀释后精液的体积，即得到稀释后精液的总体积（或重量），再将大烧杯中的精液袋提出，除皮后，再将精液袋入烧杯中，然后将稀释液缓慢加入精液中，直到达到稀释后精液的总重量，轻轻摇匀精液，按每份精液的体积（一般为100ml）分装于每个精液瓶或精液袋（精液袋应用封口机封口）。

3、如何精确计算一份精液的稀释倍数？

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首先要考虑以下几个因素： 猪 1、该份精液总量 250ml 2、精子密度 2亿/ml 3、有效精子数（保存后使用前精子活率） 0.6 4、每次输入有效精子数 10亿 5、每次输精量 20ml 该份精液的有效精子数：250ml×2×0.6=300 则分成的份数：300亿/10亿=30份 则稀释后总量：30×20=600ml 则稀释倍数：600-250/250=1.4 （三）精液的保存

精液稀释后，应放入规定保存温度的冰箱内保存，冷冻精液要按照程序降温后保存在液氮中。同时应注意保持保存需要的温度，猪的精液会发生沉淀，应每12个小时轻轻摇匀一次。如果精液不马上用于输精，应每12小时检查一次精液活力，一般低温保存或常保存的精液在输精前，精子活力不应低于0.5。可将精液最终活力下降到0.5以前，所能持续保存的时间称为这种保存稀释液的最长保存时间。

作业

1、简述基础液、低温保存稀释液、冷冻保存稀释液的制作方法。 2、卵黄、柠檬酸钠、牛奶在稀释液中各有什么作用? 3、配制稀释液和稀释精液时应注意哪些问题？

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实验三 精子活率、密度、畸形率和PH值的测定

一、实验目的

通过实验，了解精子的运动方式；识别正常精子和异常精子的形态。初步学会和掌握精液密度、精子的活率、畸形率和精液酸碱度（PH）的测定方法。熟悉肉眼检查精液品质的方法。

二、材料和仪器

（一）材料 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液

（二）器材 显微镜，载玻片，盖玻片，200 µl移液及头，5 ml试管，1 ml 移液及头，玻璃棒，酒精灯，温度计、纱布，棉花，PH比色器，PH试纸，烧杯，保温箱（恒温水浴锅）。

（三）药品 5%伊红染液，生理盐水，蒸馏水，75%酒精棉球，医用中性石蜡油，0.5%的龙胆紫酒精染液或普通红蓝墨水，95%酒精或5%溶液。

三、方法步骤

（一）精液的肉眼检查

1、射精量：将采得的精液倒入有刻度的试管或杯中，测其容量。各种家畜的平均射精量为：牛4（2～10mL）；羊1（0.7～2 mL）；猪250（150～500 mL）。如果精液量过多或过少时，分析其原因。

2、观察精液的色泽并嗅闻气味：家畜的精液通常乳白色或灰白色，因畜种的不同而又浓淡的区别。马、猪的精液稀薄，呈灰白色；牛、羊的精液浓密，呈乳白色。家畜精液无味或略有腥味。

3、云雾状的观察：取原精液一滴于在载玻片上不加盖玻片，用低倍镜观察精液滴的边缘部分，观察精液的云雾状翻腾滚动。按以下符号记入表内，云雾状显著者，以“+++”表示，有云雾状以“++”表示；云雾状不明显者以“+”表示。可见牛羊的精液翻腾滚动的云雾状态；猪马的精液无此现象。

（二）精子活率测定

测定精子活率的方法很多，有活精子计算法，死活精子染色法和目测法。目测法因使用的材料和工具不同，又可分为平板压片法、油盖检查法悬和滴检查法

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三种。现将目测法的平板压片法和油盖检查法的实验步骤分别介绍如下：

1、平板压片法

（1）将载玻片、盖玻片、玻棒等接触精液的器具洗净候干备用。用时先用蘸有75％酒精的脱脂棉球抹擦之，然后通过酒精灯进行火焰消毒，待冷候用。

（2）滴一滴精液（如太浓，可先用生理盐水稀释）于消毒过的载玻片上，盖上消毒过的干净盖玻片。

（3）将制好的片子放在显微镜载物台上，先用低倍镜观察，后用高倍镜（400～600倍）观察（如气温低，须将显微镜置于保温箱内升温到37℃后，再进行镜检）。

2、油盖检查法

（1）滴一滴精液于消毒过的载玻片上。

（2）在精液上面滴一滴医用中性石蜡油即可放在显微镜下观察。 3、精子活率的评定

（1）在显微镜下观察精子的运动方式，并区别直线前进式运动、旋转式运动和摆动式运动的精子活动的情况。

（2）根据视野中呈直线前进式运动的精子所占比例进行测定。

精子活率＝

呈直线前进运动精子数×100%

总精子数目前评定精子活率等级的方法有两种：

十级制——在显微镜视野中估算直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级，90%者为0.9级，以此类推。测定时要求多看几个视野，然后进行综合评定。在一个视野中，如果呈前进式运动的精子占多数，则重点估测非前进式运动的精子所占比例，反之则估测前进式运动的精子所占比例。

五级制——全部精子都呈直线前进运动，属于“5”级；绝大多数呈直线前进运动（约80%）为“4”级；前进运动精子略多于半数者（约60%）为“3”级；不及半数者为“2”级；呈直线前进运动的精子数目极少者属“1”级。

精子活率是精液品质评定的重要指标。受精能力与直线前进运动精子数的多少密切相关。新鲜精液的活率大于70%、冷冻精液解冻后的活率大于30%时，

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方可用于人工授精。

（三）精液密度检查

测定精液密度的方法有估测法，红细胞计数法和光电比色法。其中估测法通常结合精子活率进行检查，一般用测定活率的平板压片法进行。

取一小滴精液于清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，但不得有气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置显微镜下放大400～600倍观察，按下列等级评定其密度（如图2-1）。

图2-1 稀 中 密

1、稀：精子分散存在，精子间的空隙超过一个精子长度，这种精液一般每毫升所含精子在2亿以下。

2、中：精子之间的空隙明显，精子彼此之间距离约有一个精子的长度。有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”， 一般每毫升所含精子数约在2～10亿之间。

3、密：在整个视野中精子密度很大，彼此间空隙很小，看不清各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，一般每毫升含精子数约在10亿以上。

（四）PH的测定 1、比色试纸法

（1）取一滴精液于清洗干净的凹玻片上，然后用一小张精密试纸（6.5～8.0）放于精液滴上。

（2）让精液渗湿试纸后即在精密试纸比色图上比色，并记录结果。 （五）精子畸形率的检查

1、滴一小滴精液于消毒过的载玻片一端。

2、用另一块边缘光滑的玻片（最好为凹灶玻片）的一端斜抵于精液前成35℃角，使凹灶玻片底面与精液接触，并向两旁散开后，即向载玻片的另一端轻快推

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去，使精液均匀地涂于载玻片上。（见图2-2）

图2-2 精液抹片示意图 图2-3 左图为正常精子（左下为原生质小滴）， 右图为各种畸形精子 3、让抹片风干后，先在显微镜下观察所抹片子如何，如理想，则可染色；否则，洗去重做。

4、在风干的抹片上滴上2 ～3滴5%伊红染液，并用玻璃棒稍为推开。染色3～5min，然后轻轻用水洗去多余的染料，候干镜检。

也可以用下列方法固定染色。（1）用0.5%的龙胆紫酒精染色3min，水洗，待干后即可镜检（也可用由普通红蓝墨水代替）。（2）置95%酒精中（或5%溶液）固定5～6min，取出以水冲洗后，凉干或烘干，用蓝、红墨水等染色3～5min，再用水冲洗，干燥后置于显微镜下检查。

5、镜检：在任意若干个视野中计算200个精子中有多少个畸形精子（注意区别正常精子和头、颈、中段部以及尾部畸形的精子）。并记载于表中。（见图2-3）

6、计算精子的畸形率：

精子畸形率 = 畸形精子数 /（正常精子数＋畸形精子数）×100% 四、作业

1、列表记载本次实验所得的精液密度、精子的活率及精液PH数值。 2、将精子畸形率的检查结果详细记入下列表格中。

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项目 观察数 总计 正常 精子 头部 颈部 畸形精子 中段 尾部 总数 总观察数 畸形率（%） 3、在检查精子活率时，为了获得比较准确的结果，你认为应注意哪些事项？

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实验四 精子数量计算和死活精子百分率测定

一、目的和要求

要求学生熟练掌握血细胞计数方法它是目前许多简单而实用方法的基础；掌握死活精子百分率测定方法。

二、材料和仪器

（一）材料 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液

（二）器材 显微镜，血细胞计数室，载玻片，盖玻片，200 µl移液及头，5 ml试管，1 ml 移液及头，计数器。

（三）药品 3%氯化钠，蒸馏水，生理盐水（0.9%Nacl溶液），5%的伊红，1%的苯胺黑，95%酒精，75%酒精。

三、内容和步骤

精子密度也称为精子浓度，指每毫升精液中所含的精子数。精子密度的大小直接关系到精液稀释倍数和输精量的有效精子数，也是评定精液品质的重要指标之一。评定方法一般有目测法（估测法）和计数法。目测法在实验三已经学习，计数法目前常用的方法是血细胞计数法。

（一）精液的稀释 1、清洗器械

先将血细胞计数板及盖玻片用蒸馏水冲洗，使其自然干燥。血吸管或红细胞或白细胞稀释管先用蒸馏水冲洗，再用95%酒精冲洗，最后用乙醚清洗。试管及吸管洗净后必须烘干。

2、精液的稀释

用移液器吸取5微升原精液，缓缓加入盛有10微升3%NaCl溶液的试管中，即稀释倍数为3倍。然后用拇指按住小试管，振荡2-3min使其混合均匀。

3、精子的计数

①将清洗干净并已经晾干的计数板置于显微镜载物台上，在计数室上盖上盖玻片。

②将试管中稀释好的精液滴一滴于计数室上盖玻片的边缘，使精液自动渗入计数室。注意不要使精液溢出于盖玻片之外，也不可因精液不足而导致计数室内

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有气泡或干燥之处；如果出现有上述现象应重新再作。

③静置3min后在400-600倍显微镜检查。

④统计出计数室的四角及共5个中方格（每个中方格有16个小方格）即80个小方格内的精子数。

⑤统计每个中方格内的精子，只求中方格内及压在左线和上线的精子。 ⑥由5个中方格所统计的精子数（A）代入下列公式即得出每毫升的精子数。 每毫升精液所含精子数=A（5个大方格内的精子数）×5（等于25个大方格内的精子数）×10（等于1mm3内的精子数）×1000（等于1ml被检稀释精液样品内精子数×被检精液稀释倍数

为了减少误差，必须进行两次精子计数。如果前后两次误差大于10%，则应作第三次检查。最后在3次检查中取两次误差不超过10%的，求其平均数，即为所确定的精子数。

（二）死活精子百分率测定

活精子头部是不易着色的，镜检时，精子头部是透明、无色的。而死精子则因伊红渗入细胞质，使整个精子头部呈红色。苯胺黑为背景染色，使着色的精子头部可见。

1、将5%的伊红和1%的苯胺黑按1:1混匀，分装于1~2ml容量的试管中（加入试管容量的1/2），并在37℃水浴中加温，随后加入原精液1~3滴，摇匀后再放回水浴中，3分钟后立即取出待用。也可将染液预热后，将伊红、精液及苯胺黑按照1：1：1~2的比例及顺序滴入预热的凹玻片中混匀染色。

2、从以上混合液中用移液滴一小滴于载玻片的一端，用另一载玻片进行推动制成抹片，待干燥后，高倍镜镜检（400倍）。抹片时，最好在35~40℃的条件下制作，而且制作过程要快。也可将制好的抹片放在37~38℃保温箱内干燥30~60秒。

3、在高倍镜下数200或500个精子，其中分别数出死、活精子各占的百分率。活精子百分率总是要比精子活率高。

活精子百分率＝

活精子数×100%

总精子数四、作业及实验报告

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1、列表记载本次实习所得数值。 2、分析所得数值和一般常数的差异。

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实验五 小鼠超数排卵及早期胚胎质量鉴定

一、目的和要求

通过实验了解孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）对卵巢机能的作用。掌握超数排卵方法和早期胚胎质量鉴定，充分认识正常与异常胚胎的形态结构及等级划分标准，为家畜超数排卵和胚胎移植打下良好的基础。

二、材料和器械

（一）动物 5~6周龄供体昆明白系雌性小鼠，成年公系小鼠与之1：1配比。

（二）药品 PMSG，hCG，FSH，LH，75％酒精，冲胚液mPBS（或生理盐水），矿物油。

（三）器材 一次性注射器，镊子，剪刀，表面皿，巴氏吸管，直径为35 mm的培养皿，实体显微镜（解剖镜）。 三、内容和步骤

（一）小鼠超数排卵及胚胎采集

1、PMSG +HCG法：取5~6周龄昆明白系雌性小鼠，间隔48 h分别腹腔注射10 IU PMSG和hCG，hCG注射后与性成熟公鼠合笼，次日检查阴道栓，有栓小鼠在注射hCG后72~84 h处死，摘取子宫，在实体显微镜下，用含有mPBS液的1 ml注射器将子宫置于表面皿中冲洗3遍，以回收桑葚胚及早期囊胚。冲胚液和胚胎放在37℃恒温载物台上保存。

2、FSH+LH法：取5~6周龄昆明白系雌性小鼠，第一天晚（20：00），第二天早（8：00）、晚（20：00），第三天早（8：00）分四次每只母鼠分别腹腔注射FSH 3.6IU、2.4IU、1.8IU、1.2IU，第三天晚8：00腹腔注射LH 9IU，注射后与性成熟公鼠合笼，第四天早8：00检查阴道栓，第六天早8：00处死，摘取子宫，在实体显微镜下，用含有mPBS液的1 ml注射器将子宫置于表面皿中冲洗3遍，以回收桑葚胚及早期囊胚。冲胚液和胚胎放在37℃恒温载物台上保存。

（二）胚胎质量鉴定

将回收的胚胎用mPBS液洗净后，移入新鲜的盖有矿物油的100 μl mPBS液滴中，在40倍以上的实体显微镜进行胚胎质量鉴定。

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1．胚胎的级别划分

目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形态学的方法，将胚胎分为A级、B级、C级和D级4个级别。其中A级和B级胚胎为移植可利用胚。

（1）A级 胚胎发育形态正常，轮廓清晰，卵裂球大小均匀、致密、整齐、清晰，色泽和透明度适中，发育速度与胚胎龄相一致。

（2）B级 轮廓清晰，色泽适中，卵裂球密度和大小良好，但稍有不均，有个别卵裂球游离，发育速度与胚胎龄相一致。

（3）C级 轮廓不清晰，色泽发黑，卵裂球不十分匀称，结构松散，变形，发育较慢。

（4）D级 卵裂球多数变形、异常，发育缓慢。 2．异常胚胎

异常胚胎指胚胎体积过小、过大、呈椭圆形、扁形、带有大型极体，细胞内有大气泡，透明带破裂、收缩，卵裂球色泽发暗、界限不清、个别萎缩、边缘变得粗糙，空透明带，在透明带内无一定结构的变性胚胎等。

3．未受精卵

呈圆球形，外周有一圈折光性强且发亮的透明带，为质地均匀色泽较暗的细胞质，透明带和卵黄膜之间的间隙很小甚至看不到。

*杜氏PBS冲卵液的配制（100 ml） NaCl KCl MgCl2·6H2KH2PO4 KH2PO4 NaHPO4·12H2O 葡萄糖 丙酮酸钠 0.8 g 0.02 g 0.01 g 0.02 g 0.2903 g 0.01 g 0.0036 g CaCl2（单独用少量蒸馏水溶解后加入） 0.01 g BSA 四、实验报告

将观察到的不同发育阶段的正常胚胎、异常胚胎或未受精卵绘图并加以说明。

0.4 g 18