磷脂脂肪酸技术及其在土壤微生物研究中的应用

生󰀁󰀁态󰀁󰀁学󰀁󰀁报ACTAECOLOGICASINICAVol.26,No.7Jul.,2006

磷脂脂肪酸技术及其在土壤微生物研究中的应用

白󰀁震,何红波,张󰀁威,解宏图,张旭东

1,2

1

1,2

1,3

1,3,*

,王󰀁鸽

4

(1󰀁中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态过程重点实验室,沈阳󰀁110016;2󰀁中国科学院研究生院,北京󰀁100039;

3󰀁沈阳农田生态系统国家野外观测研究站,沈阳󰀁110016;4󰀁沈阳农业大学,沈阳110161)

摘要:以复杂群落形式存在的土壤微生物是C等养分的生物地球化学循环的主要参与者,而存在于活体微生物细胞膜的磷脂脂肪酸(PLFAs)分布广泛、含量相对恒定、周转迅速、对环境因素的变化敏感、分析方法较简单,因此该技术已广泛应用于土壤微生物学研究。阐述了PLFAs概念、命名、种类、意义、提取方法及操作过程中应注意的问题,介绍了MIDI、GC󰀁MS和HPLC󰀁ESI󰀁MS等鉴定手段。概述PLFAs技术应用途径和目的,及其在土壤微生物量、结构、代谢状态、不同农业措施对土壤微生物影响以及土壤生物修复等研究领域的应用。同时,讨论了PLFAs技术的不足。例如,对原位土壤微生物群落特定菌种指征有时不够明确;估算真菌生物量时不够准确;不能用于分析古菌;不同提取法结果区别较大且易受土壤腐殖酸等有机质干扰;供试土样必须-80󰀁或冻干保存。因此,利用PLFAs技术研究土壤微生物时,应辅以其他生物标识物及相应分析手段,才能更准确地反映土壤微生物群落组成、代谢途径与机理。关键词:提取;应用;磷脂脂肪酸;微生物;土壤

文章编号:1000󰀁0933(2006)07󰀁2387󰀁08󰀁中图分类号:S154󰀁36󰀁文献标识码:A

PLFAstechniqueandit󰀁sapplicationinthestudyofsoilmicrobiology

BAIZhen,HEHong󰀁Bo,ZHANGWei,XIEHong󰀁Tu,ZHANGXu󰀁Dong

1,2

1

1,2

1,3

1,3,*

,WANGGe󰀁

4

(1.KeyLaboratoryof

TerrestrialEcologicalProcess,InstituteofAppliedEcology,CAS,Shenyang110016,China;2.GraduateSchoolofChineseAcademyofScience,Beijing100039,China;3.NationalFieldObservationandResearchStationofShenyangAgro󰀁Ecosystems,Shenyang110016,China;4.ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China).ActaEcologicaSinica,2006,26(7):2387~2394.

Abstract:Thesoilmicroorganismsascomplexcommunitiesaretheleadingparticipantsofthebio󰀁geochemistrycyclingofCandothernutrients.Andphospholipidsfattyacids(PLFAs)canserveasanimportantindicatoroftheviablemicroorganismssincetheyexistinalltypesofmicrobialmembraneswithconstantquantityandfastturning󰀁overrate,andtheycanrespondpromptlytothevariationsinenvironmentalfactors.Therefore,therelativesimpleandvaluablePLFAstechniqueshavebeenutilizedwidelytoinvestigatethecharacteristicsofsoilmicroorganisms.

Theconception,nomenclatures,types,andcharacteristicsofPLFAsareintroducedinthispaper.DifferentextractionprocessesforPLFAsandtotalsoilfattyacidmethylesters(TSFAMEs)aresketched.Atthesametime,thecomparisonofextractionproceduresbetweenPLFAsandTSFAMEsisdrawn.Thepossibleproblemsthatarelikelytooccurduringtheextractionprocessesarediscussedindetail.ThePLFAs󰀁associatedtechniquessuchastheMIDI,GC󰀁MSandHPLC󰀁ESI󰀁MSarealsorecommendedherefortheinterpretationofPLFAsimplications.Inaddition,thispaperspecifiesthepracticalapplicationsofPLFAstothestudiesofsoilmicrobialbiomass,microbialcommunitiesandmicrobialmetabolicconditions,aswellastheeffectofagriculturalmanagementonthemicrobialcharactereristics.Someotherapplicationsarealsosummedup,forinstantce,ecosystem

基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(40535028);中国科学院知识创新工程重要方向资助项目(KZCX3󰀁SW󰀁433)收稿日期:2005󰀁11󰀁24;修订日期:2006󰀁01󰀁19

作者简介:白震(1975~),男,辽宁人,博士生,主要从事土壤微生物学研究.E󰀁mail:baizhen@iae.ac.cn*通讯作者Correspondedingauthor.E󰀁mail:xdzhang@iae.ac.cn

Foundationitem:TheprojectwassupporeedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.40535028);KnowledgeInnovationProjectofCAS(No.KZCX3󰀁SW󰀁433)

Receiveddate:2005󰀁11󰀁24;Accepteddate:2006󰀁01󰀁19

Biography:BAIZhen,Ph.D.candidate,mainlyengagedinsoilmicrobiology.E󰀁mail:baizhen@iae.ac.cn󰀁2388生󰀁态󰀁学󰀁报

13

26卷

recoverystudyandC󰀁labelingtechnique.

Meanwhile,somelimitationsbyusingPLFAsasanindicatorarefiguredoutaswell.Forexample,PLFAscan󰀁tbeusedtodistinguishthespecificmicrobialcommunitiesinthenativesoilsclearlyinsomecases.Norcantheybeusedtoevaluatethefungalbiomasscorrectlyduetotheuncertainstructuresofdifferentmicroorganisms.PLFAsanalysiscandonothingaboutArchaeaeither.Moreover,theresultsfromdifferentPLFAsextractionmethodsvarysignificantlyandareeasilyinterferedbyotherorganiccompoundsinsoilmatrix.ThesoilsamplesforPLFAsanalysismustbestoredat-80󰀁orlyophiledbecauseofoxidationeffects.

Itistherebysuggestedthatinordertoelucidateclearlythemetabolicpathwayandthestructureofnativemicrobialconsortiums,PLFAstechniquesshouldbeemployedtogetherwithothermolecularbiologicaltechniqueswhennecessary.Keywords:extraction;application;PLFAs;microorganisms;soil

土壤微生物以复杂群落而非纯培养形式存在,是生物圈中C、H、N、O和S等元素基本生物循环的重要参与者,因此它们的组成与活力深刻地影响着生物地球化学循环、有机质周转以及土壤质量。但是,目前土壤微生物学研究方法均有不足之处,如󰀁最大可能或平板计数法󰀁受培养条件而无法研究88%~99%原位土壤微生物;󰀁酶学方法󰀁只能估算功能菌群最佳代谢活力;󰀁总DNA或RNA技术󰀁不能区分活体与死体DNA、引物序列设计具有人工选择性力和功能特性。1󰀁磷脂脂肪酸技术概述

随着土壤微生物研究的深入,磷脂脂肪酸作为微生物活体指示物逐渐为人们所认识1󰀁1󰀁磷脂脂肪酸的概念、分类、命名与意义

目前已发现的磷脂物质有1000多种

[5]

[5,6]

[4]

[2,3]

[1]

。

显然,有必要分析微生物群落中其他更为独特的生化成分,以便更好地揭示土壤微生物群落原位代谢活

。

。依据极性由强到弱,磷脂可分为磷脂脂肪酸(phospholipidfatty

acids,PLFAs)、糖脂脂肪酸(glycolipidfattyacids,GLFAs)和中性脂肪酸(neutrallipidfattyacids,NLFAs)。PLFAs是微生物细胞膜主要成分,是由甘油分子的第3位羟基被磷酸、其他羟基为脂肪酸酯化而形成的,其磷酸基部分被称作极性头部,两条碳氢链被称为非极性尾部

脂肪酸通常被分成6类

[4]

[7]

。

:直链、直链顺单烯(cis󰀁)、直链反单烯(tran󰀁)、支链饱和、环状及多烯脂肪酸(这

[8]

些脂肪酸优先与磷脂甘油骨架中间C原子键合)。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯(Fattyacidmethyl

esters,FAMEs),它们又可分为:羟基取代的FAMEs(OHFAMEs);酯连接羟基取代的FAMEs(EL󰀁OHFAMEs);非酯连接羟基取代FAMEs(NEL󰀁NYFAMEs);饱和FAMEs(SAFAMEs);单不饱和FAMEs(MUFAMEs);酯连接多聚不饱和FAMEs(PUFAMEs);非酯连接不饱和FAMEs(UNSFAMEs)

[9,10]

。

不同种类PLFAs常以一系列C原子数目与希腊字母表示。比如,16󰀁1󰀁7t指的是含有󰀁16个C原子󰀁一个双键󰀁双键距甲基(󰀁)端7个C原子󰀁反式构型󰀁脂肪酸;也可将不饱和程度置于󰀁x之后,x代表距羧基端(󰀁)最近的双键位置。脂肪酸构型可用简单符号表示,如顺式(cis)󰀁(双键两侧󰀁H在同侧)与反式(trans)󰀁(双键两侧󰀁H键在异侧)分别用c󰀁与t󰀁表示;a󰀁与i󰀁代表异型(anteiso)󰀁(甲基在C末端第3位C原子上)和同型󰀁(iso󰀁)(甲基在C末端第二位碳原子上);br󰀁表示未知甲基支链的位置;ME󰀁前的数字代表甲基取代基团距分子羧基端C原子数;cy󰀁代表了环丙烷脂肪酸;󰀁󰀁与󰀁󰀁代表羟基脂肪酸的󰀁OH分别在第2、3位C原子上。

PLFAs是几乎所有活体细胞膜的主要成分,周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解

[3]

[11]

[9]

,脂肪酸结构与种

类多样,对环境因素敏感,分析结果重复性较好。既可用简单试剂和设备测定由PLFAs转化的磷酸盐以确定微生物总量,也可以根据不同菌群的特定脂肪酸C链长度、饱和度及羟基等取代基位置差异研究特殊功能菌群

[11]

。在微生物定量及活力测定方面,PLFAs与微生物量C、底物诱导呼吸(SIR)及ATP等测定方法所得结

[12]

果十分吻合。因此,PLFAs在土壤微生物学研究中极具潜力。

1󰀁2󰀁PLFAs的提取与鉴定

1󰀁2󰀁1󰀁PLFAs的提取󰀁PLFAs常用提取方法有两种。一种是PLFAs(Phospholipidlinked󰀁FAME)法,即先通过7期白震󰀁等:磷脂脂肪酸技术及其在土壤微生物研究中的应用

[13]

23󰀁

氯仿󰀁甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸FAMEs

[3,5]

,再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态

[14~16]

。另一种是通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs(totalsoilfattyacidmethylesters,TSFAMEs)。

PLFAs法步骤如下:1󰀁将8g(干重)土壤于46mL氯仿󰀁甲醇󰀁磷酸盐提取液(体积比为1󰀁2󰀁0󰀁8)两次浸提;2󰀁于上清中加入磷酸盐与氯仿各12mL振荡过夜分层,所得氯仿相用高纯N2吹干;3󰀁过活性硅胶柱,收集甲醇相,高纯N2吹干;4󰀁加1mL甲醇󰀁甲苯(体积比为1󰀁1)和1mL0󰀁2moL󰀁LKOH甲醇溶液,37󰀁保温15min;加2mL去离子水、0󰀁3mL1mol󰀁L冰醋酸(调pH值至中性

[17]

)、2mL正已烷,涡旋混匀30s后提取上层的FAMEs;

[18,19,20]

5󰀁在酯化样品中加入13󰀁0与19󰀁0甲基酯或者16󰀁0与24󰀁0甲基酯作内标PLFAs回收率。

,GC测定。Griffiths等

[21]

在

土壤中直接加入18氘化双亚麻油酸磷脂胆碱(octadeuterateddilinoleoylphosphatidylcholine,DDP或LPC)计算

TSFAMEs法步骤为:1󰀁取3g土壤(干重),加3mL3󰀁75mol󰀁LNaOH甲醇󰀁水(体积比为1󰀁1),涡旋振荡后于80󰀁水浴保温30min(此过程中细胞溶解,脂肪酸从细胞磷脂上水解下来并转移到钠盐上);2.加入6mL6mol󰀁L盐酸󰀁甲醇(体积比为1󰀁0󰀁85),85󰀁水浴保温10min(甲酯化);3󰀁加6mL正己烷-甲基丁醚(体积比为1󰀁1),将FAMEs由酸液中提取至有机相;4󰀁2500rpm离心10min,收集有机相并经N2吹干,FAMEs溶于少量正己烷后GC测定,MIDI系统分析。Drijber

[15]

认为,可采用条件较温和的碱󰀁甲醇溶液分解法(将FA从磷脂骨架

上水解下来形成FAMEs)提取酯连接而不是游离的脂肪酸,以便更准确地反映土壤活体微生物量。

PLFAs与TSFAMEs两种提取法优、缺点比较见表1。

表1󰀁PLFAs与TSFAMEs提取法的比较[9,14,15]

Table1󰀁ComparisonbetweenthePLFAsandTSFAMEsextraction[9,14,15]

PLFAs

来源及意义Originandmeaning

仅来自于活体细胞膜;可了解土壤微生物群落即时状态Comingonlyfromviablecellularmembranes;providinginformationonthepresentstatusofmicrobialcommunitiesinsoil

仅有EL󰀁脂肪酸,多为细菌特有OnlyEL󰀁PLFAsmostlyspecificforbacteria

变异系数约14%AnaverageCVofnearly14%群落指纹分析至少需要1󰀁1g土壤;测定总脂肪酸含量时至少需1󰀁8g土壤󰀁1󰀁1gtoobtainareliablecommunityfingerprint;󰀁1󰀁8gtoobtainreliabletotalFAscontents

TSFAMEs

部分来自于土壤稳定有机质(土壤腐殖质、根系);反映土壤微生物代谢史Originatingpartlyfromsoilstableorganicmatters(soilhumicsubstancesandplantroots);providinginsightintohistoryofmicrobialcommunities

酯连接与非酯连接PLFAs,多为真菌所特有,FAs多小于14CELandNon󰀁esterlinkedFAsmostlyspecificforfungi,moreFAs<14Cinlength

变异系数达40%AnaverageCVofnearly40%

群落指纹分析至少需要140mg土壤;测定总脂肪酸含量时至少需170mg土壤󰀁140mgtoobtainareliablecommunityfingerprint;󰀁170mgtoobtainreliabletotalFAscontents

脂肪酸种类TypeofFAs

精密度Precision检出限量Detectionlimit

󰀁󰀁多种因素影响PLFAs的提取效率:󰀁甲醇与土壤比例至关重要

[22]

。󰀁缓冲液及相应pH值。如用酸性柠

[23]

檬酸代替中性磷酸盐缓冲液提取酸性高有机质土壤,可提高磷脂回收率且避免无机P污染(Frosteg󰀁rd等认为,三价柠檬酸根所键合的高浓度钠离子是PLFAs高回收率的真正原因450󰀁烘4h

[24]

);又如,C14~C20PLFAs在没有其

他成分保护时会被氧化而迅速降解,提高酸度可延迟酸败。󰀁盛放磷脂的玻璃器皿应󰀁10%HCl浸泡后,于

或在400󰀁过夜󰀁去除磷脂污染

[26]

[25]

。󰀁硅胶应绝对避免与水等强极性介质接触,使用前应在

120󰀁活化2h。󰀁整个提取过程应在避光、低温(<35󰀁)条件下完成。

。土壤样品的保存也必须谨慎,以-80󰀁冷冻或冻干保藏为首选(若采土时平均温度大于

为保证PLFAs分析准确,处理土壤样品时应尽量减少筛分磨匀等操作,以保证真菌菌丝体等微生物细胞结构的完整性Drenovsky

[14]

[24]

20󰀁,则4󰀁冷藏对PLFAs测定结果的影响难以预料)。土壤样品的数量也直接影响PLFAs测定结果。例如,

发现:当土样较少时(<1󰀁1g干土重),不同PLFAs提取方法的土壤微生物组成差别极小(原因是

土样数量低时所提取的PLFAs亦少,微量脂肪酸差异难以显现);而当土壤样品较多时(󰀁1󰀁8g干土重时),不同PLFAs法分析结果差异显著(其原因是大量土样使微量PLFAs得以回收,从而展示出不同土壤微生物群落结构的细微差异)。

1󰀁2󰀁2󰀁对PLFAs的鉴定󰀁通常用MIDI系统(MicrobialIdentificationSystem)、气质联机(GasChromatography󰀁Mass󰀁2390生󰀁态󰀁学󰀁报

[27]

26卷

Spectrometry,GC󰀁MS)和液质联机等方法(HighPerformanceLiquidChromatography󰀁ElectrosprayIonization󰀁Mass

[28,29]

Spectrometry,HPLC󰀁ESI󰀁MS)鉴定PLFAs。

MIDI系统是以火焰离子检测器反复测定的标准脂肪酸保留时间为基础,用标准混合脂肪酸保留时间锁系统进一步校准,整个过程通过AutomatedSherlockR󰀁MIDI软件实现。MIDI系统能极精确地完成对二甲基乙缩醛以及典型甲酯等碳氢化合物的识别与定量。

GC󰀁MS以质谱为检测器,可获得更低的检测下限。该法可识别那些不包括在MIDI系统中的FAMEs,且可排除被MIDI系统错误识别为FAMEs的非酯成分。虽然,MIDI系统与GC󰀁MS均可定性与定量,但前者仅适用于C9~C20脂肪酸,而后者可检测大于C30脂肪酸。

HPLC󰀁ESI󰀁MS可分析完整磷脂种类(极性头部)与脂肪酸侧链(非极性尾部),能展示最初活体细胞膜磷脂分子所承载的全部信息。此系统中,磷脂类物质是通过其头部基团而不是通过其侧链分离的。2󰀁PLFAs技术在土壤微生物研究中的应用

通常,分析PLFAs有以下两个途径和目的:󰀁分析单一菌种组成以便比较或评价不同菌种特征性磷脂,提高PLFAs数据库的多项分类能力;󰀁分析自然环境或实验室中培养的个别微生物类群磷脂成分,研究特定功能菌群结构变化和代谢途径。目前,PLFAs技术已被用于细菌纯培养对外界胁迫的应答、根系排泄物对根际微生物影响、养分对泡囊丛枝菌的影响、农田土壤微生物区系特征以及诱导植物抗病性等领域2󰀁1󰀁土壤微生物量的测定

微生物量可用来估计特定环境中活性微生物数量和代谢转化能力。由于磷脂存在于所有活体细胞膜且随菌体死亡而迅速降解,因而它们是极好的标识生物量的信号分子。真细菌总PLFAs含量大致为100󰀁mol󰀁g干细胞。Sundh等

[31]

[15,30]

[9]

。

用甲烷氧化菌特定脂肪酸16󰀁1󰀁8、18󰀁1󰀁8计算不同土层甲烷氧化菌含量为0󰀁3~51󰀁10

[9]

[11]

6

细胞数󰀁克湿泥炭土。PLFAs与SIR法测定的微生物量之间的相关系数在0󰀁900~0󰀁984之间;PLFAs与总腺嘌呤核苷酸之间的相关系数为0󰀁959;菌群PLFAs含量与吖啶橙直接计数法或ATP法相关性也很好研究未知或不可培养微生物生物量带来一定的困难。2󰀁2󰀁土壤微生物菌群结构的分析

微生物群落结构决定土壤中特定生化过程能否发生。由于不同微生物体酶系不同,致使个别生物体特定脂肪酸已经在遗传上被确定下来。因此,对某些微生物来说,其特定的PLFAs是唯一的2󰀁6,9、18󰀁1󰀁9等一般为真核生物所特有G比率󰀁

-[33,35]

[33]

[4]

[25]

[1]

。但值

得注意的是,不同微生物体结构的细微差异可能会影响特定PLFAs与土壤微生物量之间的转换系数,从而为

。如C14󰀁0、

[27,32]

C16󰀁0或C18󰀁0脂肪酸存在于几乎所有土壤微生物群落磷脂中,可以作为衡量总群落生物量的指标󰀁0、18󰀁1󰀁7和cy19󰀁0总和可代表细菌总脂肪酸

[34]

;18󰀁

+

;i15󰀁0、a15󰀁0、15󰀁0、i16󰀁0、16󰀁1󰀁9、16󰀁1󰀁7t、i17󰀁0、a17󰀁0、17󰀁0、cy17

;󰀁奇数支链脂肪酸󰀁偶数单链脂肪酸󰀁的比值可表示了󰀁G󰀁

[35]

;10ME分子是放线菌或硫化还原菌等特有脂肪酸;另外,大多数放线菌含有iso󰀁或anteiso󰀁脂

[4,9]

肪酸;cis󰀁9为好氧菌特有脂肪酸;而C18󰀁1、C11󰀁1为大多数G󰀁厌氧菌所特有20󰀁4可作为特定标识物来识别并计算Gigasporarosea属菌丝体生物量󰀁1󰀁5的NLFAs󰀁PLFAs比率区分菌丝与贮存结构(Lactobacillus)标识物。

2󰀁3󰀁土壤微生物菌群代谢状态的研究

[4]

[25,37,38]

[36]

;16󰀁1󰀁5、18󰀁1󰀁9、20󰀁1󰀁9和

,其中16󰀁1󰀁5可用于估算根中孢囊

丛枝菌(AM真菌)生物量(由于AM中绝大多数NLFAs仅存在于贮存结构(例如在孢子、泡囊)中,因此可用16

);cy󰀁脂肪酸为无色菌(Achromobacter)和乳酸杆菌

菌体在代谢胁迫时会积累特殊脂肪酸,分析这些信号分子可了解逆境微生物群落原位组成。比如,细菌易积累聚󰀁󰀁󰀁羟基丁酸;真菌则合成内源性甘油三酸酯

[1,39]

。Lukas等

[40,41]

认为在某种代谢胁迫(如化学污染、

干旱、温度骤变、饥饿、高氧、低pH值等)条件下,菌体PLFAs组成可能会发生下列一种或几种变化:饱和󰀁不饱和脂肪酸、反式󰀁顺式单烯脂肪酸或总环化脂肪酸󰀁单烯前体比率升高,或者为维持脂膜流动性而诱导不饱和脂肪酸双键位置变动。Mazumder等[41]

实验表明:培养基氧浓度由11%升高到100%时,Pseudomonasjessenii7期白震󰀁等:磷脂脂肪酸技术及其在土壤微生物研究中的应用2391󰀁

菌胁迫指示物脂肪酸cy17󰀁0的浓度升高了5倍。

另一个重要的逆境指示物是甘油二酯脂肪酸(DGFA)。由于磷酸酶会迅速切去死亡菌体破裂细胞膜游离PLFAs极性头部基团并形成DGFA,因而DGFAs󰀁PLFAs可表示死亡细胞󰀁活细胞的比率Olsson等

[43]

[39]

。Ingrid等

[42]

认为,

NLFAs是能量贮存物质(且可支持菌丝体C的迁移与转化),NLFAs󰀁PLFAs比率能反映AM真菌能量贮存状态。

发现与高P介质相比,在无P或低P介质中生长的菌丝体长度会增加40%(即高P可能不利于真

[44]

菌生物量的积累)。由于腐熟时间长的微生物群落磷脂组成趋于更为常见的种类,Lei等分析可以用来确定堆肥的成熟度。

2󰀁4󰀁农田生态系统中土壤微生物区系变化的研究

首先,微生物膜磷脂成分很易受到环境或其他生物因素的影响

[24,45,46~48]

认为PLFAs组成

。比如,温度升高会导致活体微

生物膜磷脂双分子层流动性增加、非双层脂相形成,并最终导致膜的非特异性渗透、饱和或支链脂肪酸增加以及菌群脂肪酸环丙烷数量或平均C链长度变化。土壤微生物PLFAs因季节更替所引起的变化要比因旱涝灾害或施入高量有机质引起的变化大得多显的季节变化。Wilkinson

[50]

[3]

。Toyota等

[49]

PLFAs分析结果也表明土壤微生物群落结构呈现明

[51]

发现:真菌总PLFAs量不受湿度影响,而细菌则相反。Bossio等

[52]

-

认为桔秆与水

淹会导致微生物对底物与氧利用方式变更,进而显著影响菌群PLFAs组成。Clapperton等可提高土壤PLFAs含量、增强G细菌活力。

其次,施肥处理影响PLFAs组成。Pankhurst等B󰀁󰀁th与Bailey等

[12,54]

[53]

认为,蚯蚓的活动

通过PLFAs分析发现,高盐土壤中含有大量耐盐菌。

[55]

认为,由于细菌与真菌C󰀁N比率不同,因此参与土壤养分快速转化与固持的土壤微生物

证明,

库C󰀁N比率变化能反映特定施肥处理土壤N或C在真、细菌群落中贮存潜力、代谢归宿。WickC源混合底物的比例有关。Kieft

[56]

MycobacteriumfreedriksbergeneLB501T的直链PLFAs与相应的非饱和PLFAs和总饱和环状支链脂肪酸的比例与

通过对各种养分(C、N、P、Glc󰀁C、NH4NO3󰀁N、KH2PO4󰀁K)配施条件下土壤

[57]

PLFAs测定后发现:与空白相比,N或P不会增加可培养细胞数量;与N、P处理相比,有机C明显增加了可培养菌群数量;水分是醋酸盐矿化作用的主要因子,而N或P则没有影响。B󰀁hme等的。DeGrood

[58]

通过28种PLFAs的

-

主成分分析表明,有机肥与NPK处理的土著微生物区系明显不同,而这种变化主要是由G细菌与真菌引起

等发现,养分贫瘠土壤微生物区系以真菌群落为主。Cookson等

[54]

[59]

研究表明,施用干草土壤总

PLFAs含量明显高于空白、施化肥或干草+化肥处理。

最后,耕作方式改变土壤微生物PLFAs组成。Bailey

采用(双)抑制剂附加比率法(Inhibitorsadditivity

[60]

ratio,IAR)发现,在免耕土壤与草原修复土壤中积累了大量真菌。Feng等2󰀁5󰀁PLFAs分析在生物修复中的应用

发现免耕条件下PLFAs量比耕作

土壤高,他们认为湿热条件下常规耕作土壤中出现的疏松󰀁紧实󰀁恶性循环󰀁会导致有机质减少。

陆地生态修复过程包括生境功能与结构特性修复两个方面,灵敏的监测手段是生态修复过程优化的前提

[32]

。由于土壤微生物对环境变化极为敏感,因此分析土壤微生物群落PLFAs组成可反映出土壤修复过程

[11]

中各时期的细微差异。例如,Mummey等发现:真菌与细菌PLFAs组成丰度的相对变化,可评价遭受不同程

[61,62]

度破坏的土壤生态系统的恢复状况。Richard等2󰀁6󰀁标记C技术在PLFAs分析中的应用

13

认为:赤杨(Alnus)等树种会使土壤从无真菌而富含G为

+

主的菌群向富含真菌的群落结构转化,自然生态系统中的土壤微生物群落主要受真菌代谢途径的影响。

由于底物可用性以及代谢途径不同,微生物对C和C的富集存在明显差异够研究所有含C化合物的微生物同化、异化过程。Sun参入的C多于NLFAs和GLFAs。Johnsen等

13

[66]

13

[]

13

13

12

[63]

。原则上,C标记技术能

13

认为C标记技术有利于对已标记成分的代谢周转过

[65]

程与机理进行深入分析,并用来估计磷脂的代谢速率。Arao并定量菲降解微生物固醇、GLFAs以及PLFAs。Mark等

[67]

用1󰀁C醋酸盐培养土壤24h后发现,PLFAs中

13

13

将C标记菲加入土壤直接将活体代谢过程与菌体分类相结合,

利用C标记添加技术表明:不同植物(如黑麦草与

苜蓿)的不同部位(如秸杆与根部残体中)C源会参入不同土壤微生物体PLFAs中,并且土壤微生物PLFAs总󰀁2392生󰀁态󰀁学󰀁报26卷

C中来源于植物残体的仅占很少一部分。此结果一方面说明,土壤微生物对植物残体的降解具有选择性;另一方面也表明,在土壤中大多数微生物也许并不参与植物残体的降解。Malossoa等

13

13

[68]

在利用C标记的植物残

13

13

体研究有机质降解与微生物群落结构变化之间的关系时,也发现:与麦角固醇中C富集现象相反,微生物体PLFAs没有随着植物体降解而发生显著变化。显然,C标记技术通过直接将菌群活力与相应C󰀁标记代谢物相联系,极大地拓展了PLFAs技术的应用前景3󰀁PLFAs分析技术不足

尽管PLFAs可用来分析复杂的土壤微生物,但该法在应用中仍存在局限性。(1)对原位土壤微生物群落中特定菌种指征有时不够明确󰀁Bossio等

[51]

[69]

。

认为,PLFAs法所依赖的针对个

别脂肪酸标识物的细致描述源于少数可被分离的微生物纯培养。因此,在研究非培养菌群占绝大多数的原位土壤微生物时,无法证明某种脂肪酸标记物一定具有普遍的代表性。另外,不同菌种相同脂肪酸的相互叠加也难于在种水平上辩明微生物群落的确切组成

+

[70,71]

。比如,18󰀁2󰀁6存在于个别细菌体内

[9]

[61]

;G菌外层膜成

-

分脂多糖的󰀁󰀁OHFA也存在于个别G菌、真菌或植物体之中。因而,在利用PLFAs技术分析特定菌群有机质动力学时尚有一定困难

[33]

。

[22]

(2)PLFAs的提取易受其他有机质的干扰󰀁提取磷脂的颜色一般由黄色至棕色,它们主要是由腐殖酸引起的(占PLFAs总量5%~10%)

。B󰀁󰀁th

[12]

实验表明,SIR法测定微生物量󰀁C与总PLFAs回归曲线未过原

[15]

点,也说明所提取的PLFAs中存在其他杂质。

(3)用于PLFAs分析的样品不易保存󰀁Schutter等苛刻的。

(4)PLFAs技术在估算真菌生物量时尚存不足󰀁真菌PLFAs占总菌体PLFAs含量的16󰀁5%,该数值比用特定抑制剂测定的呼吸活力低很多尺度上有差异

[24]

[24]

认为,不饱和脂肪酸会在O2作用下发生自氧化作用。

因此,在好氧条件下土壤PLFAs的组成可能会发生一些不可预料的变化。另外,-80󰀁的贮存条件也是极为

。膜磷脂与细胞代谢活力之间出现这样的差异,原因可能是丝状真菌

与单细胞细菌的表面积与体积间的比率不同;或是由于真核细胞细胞器与诸如硝化细菌中薄层状结构在分类

。因此,用PLFAs法计算真菌生物量时应明确PLFAs与菌体体积、质量之间的转换系数,并

[35]

用其他方法验证。

(5)对古菌分析为力󰀁古细菌膜成分只有醚键(二醚与四醚成分为主)古细菌的组成变化。4󰀁结语

PLFAs在土壤微生物中分布广泛、种类繁多、活体外迅速降解、分析方法灵敏且重复性较好,因此可用来描述原位土壤微生物主要群落的数量特征分析方法所得结果差异显著。

因此,在应用PLFAs技术时以下几点值得考虑:󰀁分析结构特异性PLFAs,以便不断完善不同菌种的特定脂肪酸数据库;󰀁利用特定环境或特殊生理状态下不同微生物群落,揭示各种类型脂肪酸(如PLFAs与相应NLFAs、GLFAs)之间或脂肪酸与其他生物标识物(蛋白质、核酸等物质)之间密切关系;󰀁通过C󰀁底物添加技术在种水平上将功能菌群与特定有机质分解代谢相联系。只有这样,才能对土壤微生物参与的各种生物地化过程进行深入研究,才能使与土壤有关的生物层以可控方式向有利于人类生存发展的方向演化。

References:

[1]󰀁VestalJRandWhiteDC.LipidAnalysisinMicrobialEcology.BioScienc,19,39(8):535~541.[2]󰀁InsamH.Developmentsinsoilmicrobiologysincethemid1960s.Geoderma,2001,100(3󰀁4):3~402.

[3]󰀁BossioDA,ScowKM,GunapalaN,etal.DeterminantsofSoilMicrobialCommunities:EffectsofAgriculturalManagement,Season,andSoilTypeon

PhospholipidFattyAcidProfiles,Microb.Ecol.,1998,36(1):1~12.

[4]󰀁ZellesL,BaiQY,BeckT,etal.Signaturefattyacidsinphospholipidsandlipopolysaccharidesasindicatorsofmicrobialbiomassandcommunitystructure13

[72]

,因此不能用PLFAs法分析

。但其应用受到微生物特定种属PLFAs定量、定性信息缺乏的

制约;微生物个别种属的PLFAs构型相互叠加,甚至个别PLFAs所提供的菌群结构信息相互矛盾;不同PLFAs

7期白震󰀁等:磷脂脂肪酸技术及其在土壤微生物研究中的应用2393󰀁

inagriculturalsoils.SoilBiol.Biochem.,1992,24(4):317~323.

[5]󰀁TunlidandWhite,etal.MicrobialMembraneComponentsandFattyAcids.In:PAULEAandCLARKFEeds.SoilMicrobiologyAndBiochemistry.

SecondEdition.AcademicPress,1996.46~49.

[6]󰀁MorganandWinstanley.CellEnvelopeBiomarkers.In:ElsasJ.D.,TrevorsJ.T.,WellingtonEM.H.eds.ModernSoilMicrobiology,MarcelDekker,

Inc,1997.332~335.

[7]󰀁LiJW.Lipids.In:ShenT,WangJYeds.Biochemistry.Beijing:HigherEducationPress,19.44~73.

[8]󰀁SuutariM,LaaksoS.Microbialfattyacidsandthermaladaptation.CriticalReviewsinMicrobiology,1994,20(4):285~328.

[9]󰀁ZellesL.FattyacidpatternsofphospholipidsandLipopolysaccharidesinthecharacterisatonofmicrobialcommunitiesinsoil:areview.BiolFertilSoils,

1999,29(2):111~129.

[10]󰀁SteinbergerY,ZellesL,BaiQY,etal.Phospholipidfattyacidprofilesasindicatorsforthemicrobialcommunitystructureinsoilsalongaclimatictransect

intheJudeanDesert,BiolFertilSoils,1999,28(3):292~300.

[11]󰀁HillTCJ,McphersonEF,HarrisJA,etal.Microbialbiomassestimatedbyphospholipidphosphateinsoilswithdiversemicrobialcommunities.SoilBiol

Biochem.,1993,25(12):1779~1786.

[12]󰀁B󰀁󰀁thE,AndersonTH.Comparisonofsoilfungal󰀁bacterialratiosinapHgradientusingphysiologicalandPLFA󰀁basedtechniques.SoilBiology&

Biochemistry,2003,35(7):955~963.

[13]󰀁WhiteDC,DavisWM,NickelsJD,etal.Determinationofthesedimentarymicrobialbiomassbyextractiblelipidphosphate.Oecologia,1979,40(1):

51~62.

[14]󰀁DrenovskyRE,ElliottGN,GrahamKJ,etal.Comparisonofphospholipidfattyacid(PLFA)andtotalsoilfattyacidmethylesters(TSFAME)for

characterizingsoilmicrobialcommunities.SoilBiology&Biochemistry,2004,36(11):1793~1800.

[15]󰀁SchutterME,DickRP.ComparisonofFattyAcidMethylEster(FAME)MethodsforCharacterizingMicrobialCommunities.SoilSci.Soc.Am.J.,

2000,(4):1659~1668(2000).

[16]󰀁GlucksmanAM,SkipperHD,BrigmonRL,etal.UseoftheMIDI󰀁FAMEtechniquetocharacterizegroundwatercommunities.JournalofApplied

Microbiology,2000,88(4):711~719.

[17]󰀁StegeraK,Jarvis󰀁,Sm󰀁rsS,etal.Comparisonofsignaturelipidmethodstodeterminemicrobialcommunitystructureincompost.Journalof

MicrobiologicalMethods,2003,55(2):371~382.

[18]󰀁AbrahamWR,HesseCandPelzO.RatiosofCarbonIsotopesinMicrobialLipidsasanIndicatorofSubstrateUsage.AppliedandEnvironmental

Microbiology,1998,(11):4202~4209.

[19]󰀁ButlerJL,WilliamsMA,BottomleyPJ,etal.MicrobialCommunityDynamicsAssociatedwithRhizosphereCarbonFlow.AppliedandEnvironmental

Microbiology,2003,69(11):6793~6800.

[20]󰀁Kein󰀁nenMM,KorhonenLK,LehtolaMJ,etal.Themicrobialcommunitystructureofdrinkingwaterbiofilmscanbeaffectedbyphosphorusavailability.

AppliedandEnvironmentalMicrobiololgy,2002,68(1):434~439.

[21]󰀁GriffithsBS,RitzK,EbblewhiteN,etal.Soilmicrobialcommunitystructure:Effectsofsubstrateloadingrates.SoilBiologyandBiochemistry,1999,31

(1):145~153.

[22]󰀁NielsenP,PetersenSO.Ester󰀁linkedpolarlipidfattyacidprofilesofsoilmicrobialcommunities:acomparisonofextractionmethodsandevaluationof

interferencefromhumicacids.SoilBiology&Biochemistry,2000,32(8󰀁9):1241~1249.

[23]󰀁Frosteg󰀁rd󰀁,TunlidA,B󰀁󰀁thE.Microbialbiomassmeasuredastotallipidphosphateinsoilofdifferentorganiccointent.JournalofMicrobiological

Methods,1991,14(3):151~163.

[24]󰀁PetersenSOandKlugMJ.Effectsofsieving,storage,andincubationtemperatureonthephospholipidfattyacidprofileofasoilmicrobialcommunity.

AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1994,60(7):2421~2430.

[25]󰀁B󰀁󰀁thE.TheUseofNeutralLipidFattyAcidstoIndicatethePhysiologicalConditionsofSoilFungiComparisonofphospholipidfattyacid(PLFA)andtotal

soilfattyacidmethylesters(TSFAME)forcharacterizingsoilmicrobialcommunities.Microb.Ecol.,2003,45(4):373~383.

[26]󰀁Kein󰀁nenMM,KorhonenLK,MartikainenPJ,etal.Gaschromatographic󰀁massspectrometricdetectionof2󰀁and3󰀁hydroxyfattyacidsasmethylesters

fromsoil,sedimentandbiofilm.JournalofChromatogramphyB,2003,783(2)443~451.

[27]󰀁Salomonov󰀁aS,Lama󰀁cov󰀁bJ,Rul󰀁kbM,etal.Determinationofphospholipidsfattyacidsinsediments.Actauniv.Palacki.Olomuc.Fac.rer.nat.

Chemica,2003,42:39~49.

[28]󰀁KarlssonAA,MichelsenP,LarsenA.Normal󰀁phaseliquidchromatographyclassseparationandspeciesdeterminationofphospholipidsutilizingelectrospray

massspectrometry󰀁tandemmassspectrometry.RapidCommunicationsinMassSpectrometry,1996,10(7):775~780.

[29]󰀁FangJ,BarcelonaMJ,AlvarezPJ.Adirectcomparisonbetweenfattyacidanalysisandintactphospholipidprofilingformicrobialidentification.Organic

Geochemistry,2000,31(4):881~887.

[30]󰀁EroshinVK,DedyukhinaEG.EffectoflipidsfromMortierellahygrophilaonplantresistancetohytopathogens.WorldJournalofMicrobiology&

Biotechnology,2002,18(2):165~167.

[31]󰀁SundhI,Borg󰀁P,NilssonM,etal.Estimationofcellnumbersofmethanotrophicbacteriainborealpeatlandsbasedonanalysisofspecificphospholipid

fattyacids,FEMSMicrobiologyEcology,1995,18(2):103~112.

[32]󰀁MummeyDL,StahlPD,BuyerJS.Microbialbiomarkersasanindicatorofecosystemrecoveryfollowingsurfaceminereclamation.AppliedSoilEcology,

2002,21(3):251~259.

[33]󰀁Frotegard󰀁,B󰀁󰀁thE,TunlidA.Shiftsinthestructureofsoilmicrobialcommunitiesinlimedforestsasrevealedbyphospholipidsfattyacidanalysis.Soil

BoilBiochem.,1993,25(6):723~732.

[34]󰀁PrihaO,GraystonSJ,PennanenT,etal.MicrobialactivitiesrelatedtoCandNcyclingandmicrobialcommunitystructureintherhizospheresofPinus

sylvestris,PiceaabiesandBetulapendulaseedlingsinanorganicandmineralsoil.FEMSMicrobiologyEcology,1999,30(2):187~199.

[35]󰀁BaiQ,GattingerA,ZellesL.CharacterizationofMicrobialConsortiainPaddyRiceSoilbyPhospholipidAnalysis,MicrobEcol,2000,39(4):273~281.[36]󰀁SakamotoK,IijimaT,HiguchiR.Useofspecificphosphorlipidfattyacidsforidentifyingandquantifyingtheexternalhyphaeofthearbuscularmycorrhizal

fungusGigasporarosea,SoilBiology&Biochemistry,2004,36(11):1827~1834.

[37]󰀁OlssonaPA,ThingstrupbI,JakobsenbI,etal.Estimationofthebiomassofarbuscularmycorrhizalfungiinalinseedfield.SoilBiologyandBiochemistry,

1999,31(13):1879~1887.

[38]󰀁NielsenKB,RasmusKJ,OlssonPA,etal.ColonizationandmoleculardiversityofArbuscularMycorrhizalFungiintheaquaticplantsLittorellauniflora

andLobeliadortmannainsouthernSweden,Mycol.TheBritishMycologicalSociety,2004,108(6):616~625.

[39]󰀁KIEFTTL,RingelbergDB,WhiteDC.ChangesinEster󰀁linkedphospholipidfattyacidprofilesofsubsurfacebacteriaduringstarvationanddesiccationin

aporousmedium.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1994,60(9):3292~3299.

[40]󰀁WickLY,PelzO,BernasconiSM,etal.Influenceofthegrowthsubstrateonester󰀁linkedphospho󰀁andglycolipidfattyacidsofPAH󰀁degradingM.sp.󰀁2394生󰀁态󰀁学󰀁报26卷

LB501T.EnvironmentalMicrobiology,2003,5(8):672~680.

[41]󰀁MazumderR,PinkartHC,AlbanPS,etal.Low󰀁SubstrateRegulatedMicroaerophilicBehaviorasaStressResponseofAquaticandSoilBacteria,Current

Microbiology,2000,41(2):79~83.

[42]󰀁AarleIM,OlssonPA.FungalLipidAccumulationandDevelopmentofMycelialStructuresbyTwoArbuscularMycorrhizalFungi.Appliedand

EnvironmentalMicrobiology,2003,69(11):6762~6767.

[43]󰀁OlssonPA,AarleIM,AllawayWG,etal.PhosphorusEffectsonMetabolicProcessesinMonoxenicArbuscularMycorrhizaCultures.PlantPhysiology,

2002,130(3):1162~1171.

[44]󰀁LeiF,VanderGheynstJS.TheeffectofmicrobialinoculationandpHonmicrobialcommunitystructurechangesduringcomposting.ProcessBiochemistry,

2000,35(9):923~929.

[45]󰀁BOGGSLC,KennedyAC,ReganoldJP.UseofPhospholipidfattyacidsandcarbonsourceutilizationpatternstotrackmicrobialcommuinitysuccessionin

developingcompost,AppliedandEnvironmetalMicrobiology,1998,(10):4062~40.

[46]󰀁BoggsLC,KennedyAC.UseofPLFAandcarbonsourceutilizationpatternstotrackmicrobialcommunitysuccessionindevelopingcompost,Appliedand

EnvironmentalMicrobiology,1998,(10):4062~40.

[47]󰀁RingelbergDB,SuttonS,WhiteDC.Biomass,bioactivityandbiodiversity:microbialecologyofthedeepsubsurface:analysisofester󰀁linkedphospholipid

fattyacids.FEMSMicrobiologyReview,1997,20(3󰀁4):371~377.

[48]󰀁PetersenSP,FrohnePS,KennedyAC.DivisionS󰀁3󰀁SoilBiology&BiochemistryDynamicsofaSoilMicrobialCommunityunderSpringWheat.Soil

Sci.Soc.Am.J.,2002,66(3):826~833.

[49]󰀁ToyotaK,KuninagaS.Comparisonofsoilmicrobialcommunitybetweensoilsamendedwithorwithoutfarmyardmanure.AppliedSoilEcology,Available

online28October2005.

[50]󰀁WilkinsonSC,AndersonJM.SpatialPatternsofSoilMicrobialCommunitiesinaNorwaySpruce(Piceaabies)Plantation.MicrobEcol,2001,42(3):

248~255.

[51]󰀁BossioDA,ScowKM.ImpactsofCarbonandFloodingonSoilMicrobialCommunities:PhospholipidFattyAcidProfilesandSubstrateUtilizationPatterns.

MicrobEcol.,1998,35(3):265~278.

[52]󰀁ClappertonMJ,LeeNO,BinetF,etal.Earthwormsindirectlyreduceetheeffectsoftake󰀁all(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)onsoftwhitespring

wheat(Triticumaestivumcv.Fielder).SoilBiology&Biochemistry,2001,33(11):1531~1538.

[53]󰀁PankhurstCE,YuS,HawkeBG,etal.Capacityoffattyacidprofilesandsubstrateutilizationpatternstodescribedifferencesinsoilmicrobial

communitiesassociatedwithincreasedsalinityoralkalinityatthreelocationsinSouthAustralia.BiolFertilSoil,2001,33(3):204~217.

[54]󰀁BaileyVL,SmithJL,BoltonHJr.Fungal󰀁to󰀁bacterialratiosinsoilsinvestigatedforenhancedCsequestration.SoilBiology&Biochemistry,2002,34(7):

997~1007.

[55]󰀁WickLY,PascheN,BernasconiSM.CharacterizationofMultiple󰀁SubstrateUtilizationbyAnthracene󰀁DegradingMycobacteriumfreedriksbergene

LB501T.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2003,69(10):6133~6142.

[56]󰀁KieftTL,KovacikWP.Factorslimitingmicrobialgrowthandactivityataproposedhigh󰀁levelNuclearrepository,YuccaMountain,Nevada.Appliedand

EnvironmentalMicrobiology,1997,63(8):3128~3133.

[57]󰀁B󰀁hmeL,LangerU,B󰀁hmeF.Microbialbiomass,enzymeactivitiesandmicrobialcommunitystructureintwoEuropeanlong󰀁termfieldexperiments.

Agriculture,EcosystemsandEnvironment,2005,109(1󰀁2):141~152.

[58]󰀁DeGroodSH,ClaassenVP,ScowKM.Microbialcommunitycompositiononnativeanddrasticallydisturbedserpentinesoils.SoilBiology&

Biochemistry,2005,37(8):1427~1435.

[59]󰀁CooksonWR,AbayeDA,MarschnerP,etal.Thecontributionofsoilorganicmatterfractionstocarbonandnitrogenmineralizationandmicrobial

communitysizeandstructure.SoilBiology&Biochemistry,2005,37(9):1726~1737.

[60]󰀁FengY,MottaAC,ReevesDW,etal.Soilmicrobialcommunitiesunderconventional󰀁tillandno󰀁tillcontinuouscottonsystems.SoilBiology&

Biochemistry,2003,35(1):1693~1703.

[61]󰀁RichardDB,WalkerbLR.Impactofcolonizerplantspeciesonthedevelopmentofdecomposermicrobialcommunitiesfollowingdeglaciation.SoilBiology

&Biochemistry,2004,36(3):555~559.

[62]󰀁RichardDB,WalkerbLR.Themeasurementofsoilfungal:bacterialbiomassratiosasanindicatorofecosystemself󰀁regulationintemperatemeadow

grasslands,BiolFertilSoil,1999,29(3):282~290.

[63]󰀁ZhangCL.Stablecarbonisotopesoflipidbiomarkers:analysisofmetabolitesandmetabolicfatesofenvironmentalmicroorganisms.CurrentOpinionin

Biotechnology,2002,13(1):25~30.

[]󰀁SunMY.Massspectrometriccharacterizationof13C󰀁labeledlipidtracersandtheirdegradationproductsinmicrocosmsediments,AppliedandEnvironmental

Microbiology,2000,66(2):455~466.

[65]󰀁AraoT.Insitudetectionofchangesinsoilbacterialandfungalactivitiesbymeasuring13Cincorporationintosoilphospholipidfattyacidsfrom13Cacetate.

SoilBiologyandBiochemistry,1999,31(7):1015~1020.

[66]󰀁JohnsenAR,WindingA,KarlsonU,etal.LinkingofMicroorganismstoPhenanthreneMetabolisminSoilbyAnalysisof13C󰀁LabeledCellLipids.Applied

andEnvironmentalMicrobiology,2002,68(12):6106~6113.

[67]󰀁MarkA,WilliamsMA,MyroldDD,BottomleyPJ.Carbonflowfrom13C󰀁labeledstrawandrootresiduesintothephospholipidfattyacidsofasoil

microbialcommunityunderfieldconditions.SoilBiology&Biochemistry.Availableonline,28July2005.1~10.

[68]󰀁MalossoaE,EnglishbL,HopkinsbDW,etal.Useof13C󰀁labelledplantmaterialsandergosterol,PLFAandNLFAanalysestoinvestigateorganicmatter

decompositioninAntarcticsoil.SoilBiology&Biochemistry,2004:36(1):165~175.

[69]󰀁BoschkerHTS,NoldSC,WellsburyP,etal.Directlinkingofmicrobialpopulationstospecificbiogeochemicalprocessesby13C󰀁labellingofbiomarkers.

Nature,1998,392(23):801~805.

[70]󰀁CrossmanZM,WangZP,InesonP,etal.Investigationoftheeffectofammoniumsulfateonpopulationsofambientmethaneoxidisingbacteriaby13C󰀁

labellingandGC󰀁C󰀁IRMSanalysisofphospholipidfattyacids.SoilBiology&Biochemistry.Availableonline,23September2005.1~8.

[71]󰀁JoergensenaRG,PotthoffMb.Microbialreactioninactivity,biomass,andcommunitystructureafterlong󰀁termcontinuousmixingofagrasslandsoil.Soil

Biology&Biochemistry,2005,37(7):1249~1258.

[72]󰀁KaurA,ChaudharyA,KaurA,etal.Phospholipidfattyacid󰀁Abioindicatorofenvironmentmonitoringandassessmentinsoilecosystem.CurrentScience,

2005,(7):1103~1112.

参考文献:

[7]󰀁李建武.脂类.见:沈同,王镜岩主编.生物化学.北京:高等教育出版社,19.44~73.