·７２４·
中国医科大学学报第３７卷第６期２００８年１２月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶｏｌ．３７Ｎｏ．６Ｄｅｃ．２００８
３种胃癌细胞株中ＧＳＴＰ１基因表达及其启动子区甲基化状态的研究
张晔1，曲秀娟1，刘云鹏1，荆薇1，杨向红2，侯科佐1，滕月娥1
（中国医科大学１．附属第一医院肿瘤内科，沈阳１１０００１；２．附属盛京医院病理科，沈阳１１０００４）
摘要：目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达
采用RT-PCR和Westernblot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、
人胃癌细
水平与其启动子区甲基化的相关性。方法
BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR（MSP）法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后，
胞株BGC823和SGC7901中GSTP1mRNA和蛋白呈阳性表达，MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达；BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化，而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态；经5-氮杂胞苷药物干预后，MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论中图分类号：R735.2
胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。
文章编号：0258-46（2008）06-0724-03
关键词：GSTP1基因；DNA甲基化；胃癌；5-氮杂胞苷
文献标志码：A
PromoterMethylationandExpressionofGSTP1GeneinHumanGastricCancerCellLlinesZHANGYe1，QUXiu-juan1，LIUYun-peng1，JINGWei1，YANGXiang-hong2，HOUKe-zuo1，TENGYue-e1
（1.DepartmentofMedicalOncology，TheFirstAfficiatedHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；2.DepartmentofPathology，ShengjingChinaMedicalUniverisity，Shenyang110004，China）Hospital，
Abstract：Objectivetigated.Methods
ToexplorewhetheraberrantmethylationisacontributionfactortotranscriptionalinactivationofGSTP1ingastric
cancercelllinesviatheinvestigationoftheexpressionandmethylationstatusofGSTP1geneinhumangastriccancercelllineswereinves－
RT-PCRandWestern-BlotmethodwereusedtoexploremRNAandproteinexpressionoftheGSTP1gene.Methylation
specificPCR（MSP）wasusedtotestpromotermethylationofGSTP1geneinMGC803，BGC823andSGC7901.Thehypermethylationstatus）.Resultswasreversedbyaddingvariousconcentrationof5-aza-2′-deoxycytidine（5-aza-dC
GSTP1geneandproteinexpressionwereob－
viouslyexpressedinBGC823andSGC7901celllines，bothcelllinesshowednomethylation.Onthecontrary，lossofGSTP1mRNAandproteinexpressionwasdetectedinMGC803duetothemethylationofCpGislandofGSTP1gene.Afterthetreatmentof5-aza-dCinhyper－methylationcelllineMGC803，thelevelsofGSTP1proteinexpressionswereincreasedobviously.ConclusionKeywords：GSTP1gene；DNAmethylation；gastriccancer；5-aza-2′-deoxycitydine
Thispromoterhypermethyla－
tioniscorrelatedwithGSTP1geneexpressioninhumangastriccancerMGC803celllineandplaysakeyroleinGSTP1silencing.
GSTP1（glutathione-S-transferaseP1，GSTP1）是GSTS家族中酸性同工酶π的编码基因，19年BOARD等
［1］
肿瘤中发病机制的研究陆续展开。EILERS等［3］研究认为，前列腺癌中GSTP1基因启动子区域高甲基化可导致该基因表达沉默。ARAI等［4］研究认为，乳腺癌中GSTP1基因启动子区甲基化状态与患者预后密切相关。但GSTP1基因在胃癌中的表达情况及其机制尚未阐明。因此，我们选择了3种胃癌细胞株，研究了GSTP1基因的表达及其启动子区的甲基化状态，旨在探讨胃癌细胞中GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。11.1
材料与方法材料
5-氮杂胞苷（5-aza-2′-deoxycitydine，5-aza-dC）购自Sigma公司，总RNA抽提试剂TRIzol购自In－vitrogen公司，RT-PCR试剂盒，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase酶及dNTP购自TaKaRa公司，
分离了人类GSTP1基因的cDNA克
GSTP1基因编码产物隆，将其定位于染色体11q13。GST-π，主要通过催化还原型谷胱甘肽和多种亲电子化合物结合，使其更具极性而加强环境致癌物的排出，从而达到解毒的目的。19年NIISU等［2］首先证实检测患者血清中GST-π的水平可作为识别胃肠道恶性肿瘤的分子标志物，并认为该基因的改随之，GSTP1变是胃肠道肿瘤的早期发生事件之一。
基因的功能及其在前列腺癌、肺癌和乳腺癌等恶性
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30770993）；辽宁省科技攻
关计划项目（2004225004-11）
作者简介：张晔（1976-），女，讲师，博士研究生.通讯作者：刘云鹏，E-mail：cmuliuyunpeng@yahoo.cn收稿日期：2008-09-25
第６期张晔等.3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究
·７２５·
GSTP1鼠抗人mAb购自Santa公司，WizardDNAClean-up购自Promega公司。1.2
细胞株及细胞培养
人胃腺癌细胞系MGC803、BGC823及SGC7901由中国医科大学肿瘤研究所保存，在含100ml/L胎牛血清、12U/ml庆大霉素的RPMI10中，37℃，饱和湿度及5%CO2的孵育箱内传代培养。1.3
细胞总RNA提取
用TRIzol试剂提取细胞总RNA。逆转录酶和Oliga（dT）20引物合成cDNA。GSTP1引物序列：上游5′-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3′，下游5′-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3′，扩增产物长度453bp。β-actin为内对照，上游5′-GTGGGGCGCC－CCAGGCACCA-3′，下游5′-CTCCTTAATGTCACG－CACGATTTC-3′，扩增长度为498bp。PCR反应条件为：95℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃10min。取产物20μl于2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色5min后凝胶成像分析仪照相、分析DNA条带。实验重复3次。1.4
Westernblot检测GSTP1蛋白表达
4℃预冷PBS洗涤MGC803细胞，收集2×106
个，裂解于100μl含有蛋白酶抑制剂（1mmol/LPMSF，2μg/mlAprotitin）的RIPA裂解液中，超声粉碎（30J，
5s/次，5次），4℃裂解40min，4℃15000r/min，离心30min取上清。采用Lowry法进行总蛋白定量。以1∶2比例与3×样品缓冲液混匀，煮沸5min。将样品（22μg/lane）在12%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳2h。后通过半干式转印（恒流60mA20min，后120mA15min）转印到纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜，一抗（鼠抗人GSTP11∶200），4℃过夜，二抗（山羊抗鼠1∶800）室温孵育30min，显色、图像采集及分析处理［5］。实验重复3次。1.5
基因组DNA的制备、亚硫酸氢盐修饰及甲基
化特异性聚合酶链反应（methylationspecificPCR，MSP）检测
采用常规酚-氯仿-异戊醇法提取细胞DNA，紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度。按文献［6］方法进行DNA修饰及纯化。MSP反应体系50μl，包括模版DNA1μl，5×PrimeSTARTMbuffer10μl，引物各1μl，dNTP4μl，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase酶0.5μl，加双蒸水至50μl。反应条件：95℃15min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环；72℃10min，甲基化和非甲基化反应退火温度均为59℃。双
蒸水作为空白对照。甲基化引物：上游5′-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3′，下游5′-GCCC－CAATACTAAATCACGACG-3′，扩增产物93bp；非甲基化引物：上游5′-GATGTTTGGGGTGTAGTG－GTTGTT-3′，下游5′-CCACCCCAATACTAAATCA－CAACA-3′，扩增产物97bp。取PCR产物20μl于2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色5min后观察DNA条带。实验重复3次。1.6
去甲基化药物5-aza-dC处理MGC803细胞在含10ml/L胎牛血清的RPMI10中饥饿培养24h后，分别用终浓度为5和10μmmol/L的5-aza-dC处理MGC803细胞，在第1，3天换同样浓度加药培养液，第5天收集细胞，进行实验。以未加药物干预的细胞为对照组。2结果2.1
MGC803、BGC823和SGC7901细胞中GSTP1基因mRNA及蛋白表达
RT-PCR检测结果显示，胃癌细胞株BGC823和SGC7901出现453bp大小的目的条带，而MGC803细胞株未检测到GSTP1mRNA表达，见图1A；同样，Westernblot检测结果表明，BGC823和SGC7901细胞中GSTP1蛋白呈阳性表达，而MGC803细胞中GSTP1蛋白呈阴性表达，见图1B。
1234567
321
GSTP1→
←β-actin←GSTP1←微管蛋白A
B
1：SGC7901；2：BGC823；3：MGC803；4：H2O阴性对照；5：Marker；
6~9：β-actin图１ＲＴ-ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测胃癌细胞株ＧＳＴＰ１ｍＲＮＡ和蛋白表达
Ｆｉｇ．１
ＬｅｖｅｌｓｏｆＧＳＴＰ１ｍＲＮＡｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｇａｓ－ｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｂｙＲＴ-ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
2.2
GSTP1基因启动子区甲基化状态
MSP检测结果显示，胃癌BGC823和SGC7901
细胞株GSTP1基因非甲基化引物扩增出97bp大小的目的条带，MGC803细胞株甲基化引物扩增出93bp目的条带（图2）。2.3
5-aza-dC处理MGC803后GSTP1蛋白的表达在分别给予5和10μmol/L5-aza-dC处理MGC803细胞5d后，GSTP1蛋白表达较对照组明显增强（图3）。
·７２６·
1
M
200bp100bp
1：Marker；2：H2O阴性对照；3：MGC803；4：BGC823；5：SGC7901；U：非甲基化；M：甲基化
图２ＭＳＰ检测３种胃癌细胞株中ＧＳＴＰ１基因甲基化状态．Ｆｉｇ．２
ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＧＳＴＰ１ＣｐＧｉｓｌａｎｄｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ
1
2
3
←GSTP1←微管蛋白
1：对照组；2：5μmol/L5-aza-dC处理组；3：10μmol/L5-aza-dC处理组
图３不同浓度５-ａｚａ-ｄＣ处理ＭＧＣ８０３细胞后ＧＳＴＰ１蛋白的表达Ｆｉｇ．３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＧＳＴＰ１ｐｒｏｔｅｉｎｓａｆｔｅｒｄｅａｌｉｎｇｗｉｔｈ５-ａｚａ-ｄＣ
ｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
2U
M3U
M4U
M5U
中国医科大学学报第３７卷
GSTP1基因失活的主要原因之一，5-aza-dC可通过逆转GSTP1基因甲基化状态，上调GSTP1基因表达。
目前，TOZAWA等［7］报道胃癌细胞株（MKN45/）的GSTP1mRNA水平与顺铂耐药密切相关。CDDP
ZHANGJUN等［8］用免疫组化法观察胃癌组织中
GSTP1表达与化疗药物敏感性的关系，发现GSTP1阳性表达与顺铂的体外耐药明显相关。提示GSTP1表达缺失的胃癌细胞对铂类相对敏感，提示我们可以应用GSTP1基因检测作为胃癌患者临床应用铂类化疗药物疗效的预测分子，根据不同肿瘤个体表选择相对敏感的化疗药物，为临达GSTP1的不同，
床深入开展“常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗”提供依据和支持，从而使化疗走进个体化时代。
参考文献：
［1］BOARDPG，WEBBGC，COGGANM.IsolationofacDNAcloneand
3讨论
表观遗传学在肿瘤发生发展中具有重要的作
localizationofthehumanglutathioneS-transferase3genestochro－mosomebands11q13and12q13-14［J］.AnnHumGenet，19，53（3）：205-213.
［2］NIISUY，TAKAHASHIY，SAITOT，etal.Serumglutathione-S-transferase-piasatumormarkerforgastrointestinalmalignancies［J］.Cancer，19，63（2）：317-323.
［3］EILERST，MACHTENSS，TEZYALH，etal.Prospectivediagnostic
efficiencyofbiopsywashingDNAGSTP1islandhypermethylationfor.Prostate，2007，67detectionofadenocarcinomaoftheprostate［J］（7）：757-763.
［4］ARAIT，MIYOSHIY，KIMSJ，etal.AssociationofGSTP1CpGis－
landshypermethylationwithpoorprognosisinhumanbreastcancer［J］.BreastCancerResTreat，2006，100（2）：169-176.
［5］KOLLERMANNJ，KEMPKENSTEFFENC，HELPAPB，etal.Im－
pactofhormonaltherapyonthedetectionofpromoterhypermethyla－tionofthedetoxifyingglutathione-S-transferaseP1gene（GSTP1）in.BMCUrol，2006，6：15.prostatecancer［J］
［6］CHUANGCK，CHUDC，TZOURD，etal.Hypermethylationofthe
CpGislandsinthepromoterregionflankingGSTP1geneisapoten－tialplasmaDNAbiomarkerfordetectingprostatecarcinoma［J］.2007，31（1）：59-63.CancerDetectPrev，
［7］TOZAWAK，OSHIMAT，KOBAYASHIT，etal.Oxaliplatinintreat－
mentofthecisplatin-resistantMKN45celllineofgastriccancer［J］.AnticancerRes，2008，28（4B）：2087-2092.
［8］ZHANGJUN，ZHUZHENG-GANG，JIJUN，etal.GlutathioneStrans－
ferase-πexpressioninhumangastriccanceranditsrelationshiptochemosensitivity［J］.JournalofShanghaiSecondMedicalUniversi－ty，2003，2（1）：1-4.
（编辑武玉欣）
DNA甲基化被认为是肿瘤形成的重要机制之用，
一。其主要特征是广泛癌基因低甲基化和部分区域抑癌基因高甲基化共存，抑癌基因启动子区域的高甲基化引起其转录抑制，进一步导致抑癌基因失活，从而推测DNA甲基化参与肿瘤的发生发展［6］。
目前研究认为，GSTP1基因沉默与多种肿瘤的发生发展密切相关，而GSTP1基因启动子区异常甲基化被认为是其失活的主要机制［3］。为进一步明确胃癌细胞株中GSTP1基因沉默是否与甲基化相关，我们应用RT-PCR和Westernblot技术检测了胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中GSTP1基因的mRNA和蛋白表达情况，结果显示BGC823和SGC7901胃癌细胞株中GSTP1基因的mRNA和蛋白表达阳性，而MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默。在此基础上，我们进一步检测了3种胃癌细分析结果胞株中GSTP1基因启动子区甲基化状态，表明BGC823和SGC7901细胞株中GSTP1基因启动子区成非甲基化状态，而MGC803细胞株中呈现
GSTP1基因启动子区高甲基化。分别用5和10μmol/L去甲基化药物5-aza-dC处理MGC803细胞5d后，GSTP1蛋白表达较对照组明显增强。上述结果提示启动子区异常甲基化是胃癌MGC803细胞
