基因组甲基化(1)

名字，学号

（XX学院，江苏 徐州 221000）

摘 要：在DNA甲基化胞嘧啶环的五位发生在CpG二核苷酸的哺乳动物最基因组，是必不可少的胚胎存活率。随着目前已知的几个关键蛋白，它已成为可能的方法的生物学意义表观遗传系统通过生化和遗传学。结果，我们在我们的了解基因的机制甲基化是针对特定区域的基因组的甲基化CpG结合蛋白的解释。最近的研究阐明了脱氧核糖核酸的作用控制基因表达的甲基化加强与组蛋白修饰的联系染色质重塑。 关键词：生物；CHO细胞；蛋白质组学；转录组学；代谢组学；合理优化

基因组中的甲基化被发现生物包括原核生物和真核生物。在原核生物，DNA甲基化发生在胞嘧啶和腺嘌呤基地，包括主机的一部分约束系统（在文献[1]回顾）。在多细胞然而，真核生物，甲基化似乎只限于胞嘧啶碱基与压抑有关染色质状态和基因表达的抑制[2]。甲基化对小鼠的生存能力至关重要，因为DNA甲基转移酶的破坏性酶的杀伤力[3]。脱氧核糖核酸的一般机制甲基化抑制基因表达：第一，修饰胞嘧啶碱基可以抑制某些研究协会与同源的DNA识别因素序列[5]；第二，蛋白质识别甲基化CpG甲基化可以引起潜在的压抑DNA[6]。甲基CpG结合蛋白（Mbps）的使用转录共抑制分子的沉默转录并修改周围的染色质，提供甲基化与染色质重塑的联系和修改[7]。在这篇综述中，我们专注于我们的最新进展甲基化机制的认识有针对性的转录抑制和口译中的甲基化CpG信号Mbps的作用沉默基因表达。我们强调的例子哺乳动物系统，包括动物模型的研究，因为最近几次的评论已经讨论了基因的主题植物和真菌中的甲基化和沉默[8]。

1 Targeting DNA甲基化

1.1 DNA甲基转移酶

DNA甲基转移酶哺乳动物DNA胞嘧啶甲基转移酶酶配合以他们的首选基因为基础的一般类衬底。从头甲基化酶Dnmt3a和DNMT3B主要负责介绍胞嘧啶。在非甲基化CpG位点甲基化之前，而维护甲基转移酶将预先存在的甲基化模式复制到新的复制过程中的脱氧核糖核酸链。四分之一脱氧核糖核酸甲基转移酶、DNMT2，显示弱的DNA甲基转移酶活性在体外[9]，但有针对性地删除胚胎干细胞有着密切的基因无对全球甲基化的影响，这表明这种酶在设置核酸酶的参与程度不多甲基化模[10]。

DNMT3L是一种酶相关蛋白活性的影响不包含内在的DNA甲基转移酶的活性，但身体同伙DNMT3A和DNMT3B和调节其催化活性[11]。结合，这些从头甲基转移酶似乎与维护构成脱氧核糖核酸的核心酶组分哺乳动物甲基化系统。 1.2 靶向从头甲基化的机制

是一种酶相关蛋白活性的影响不包含内在的DNA甲基转移酶的活性，但身体同伙DNMT3A和DNMT3B和调节其催化活性[12]。结合，这些从头甲基转移酶似乎与维护构成脱氧核糖核酸的核心酶组分哺乳动物甲基化系统。靶向从头甲基化的机制全球从头甲基化的例子已经很好记录在生殖细胞发育和早期胚胎发育过程中，当许多甲基化标记是再后基因组甲基化[13]阶段建立。这是很难学习的机制，DNA甲基转移酶酶被招募到有针对性的脱氧核糖核酸序列这些时代，由于少量的生物分子和生物化学研究的材料。大多数目前的知识，针对的脱氧核糖核酸因此甲基化从头因此来自细胞培养模型系统。这些研究至少表明三个可能的方法，从头甲基化可能有针对性的：第一，Dnmt3酶本身可能通过特定的域识别核酸或染色质，第二，DNMT3A和DNMT3B可能通过招聘–与转录抑制蛋白相互作用的蛋白或其他因素；第三，核糖核酸干扰（RNAi）系统可能目标从头甲基化到特定的脱氧核糖核酸序列。在这里，我们考虑关于这些可能性的证据。在小鼠细胞，部分定位于Dnmt3酶着丝粒异染色质的地区。功能研究表明，保守的重构需要目标的催化活性。

这些地区，DNMT3A基因组。这一领域的重要性被高亮显示的发现，一个突变的人的重构使ICF DNMT3b蛋白综合征，严重的常染色体隐性遗传病人类[14]。突变废除正常染色质结合组织培养细胞[15] DNMT3B和原因经典卫星2甲基化的研究受影响的人的脱氧核糖核酸[16]。晶体结构，老鼠DNMT3B PWWP域已经解决，和在体外的证据表明，这一域可能会相互作用用序列的方式的核酸[11]。值得注意的是，PWWP域共享结构的相似性与―都铎域发现53BP1，蛋白质结合组蛋白尾巴的H3赖氨酸79亚基的改性[18]。确定组蛋白是否有意思修改也参与了针对该基因通过他们的PWWP结构域的蛋白质。DNMTs也可以有针对性的内源性基因站点特定的转录抑制作用蛋白质。

这个想法是首次提出的致癌融合蛋白PML–rar，可以招募DNA甲基转移酶和甲基化的原因靶基因在肿瘤细胞中[19]。最近，Brenneret表明，Myc蛋白结合DNA甲基转移酶的活性，而直接DNMT3A和myc基因之间的相互作用是必需的该Myc靶基因p21Cip1有效压制。利用组织培养的染色质免疫沉淀研究，细胞均显示myc是必需的DNMT3A的p21启动子区招聘，导致从头甲基化的细胞启动子。DNMT3A DNA甲基转移酶活性这种基因沉默的事件，因为在催化领域的一个点突变缓解沉默。这个在正常的表达DNMT3A的确切作用p21基因还有待进一步研究，但该模型系统揭示了一个潜在的机制，去从头甲基化被招募的因素抑制转录。

桑托罗等人的一系列研究，表明DNA甲基化作用的抑制编码核糖体RNA（rRNA）基因的表达。这沉默事件依赖于一个单一的从头甲基化CpG二核苷酸的rRNA基因启动子区基因。Tip5，NORC阻遏复杂的组件，两DNMT3B和DNMT1联营，提供NORC沉默之间的rRNA基因和链接甲基化系统。染色质免疫沉淀分析表明，酶的酶积极招募的rRNA基因启动子区基因[20]，和随后的沉默是依赖于甲基甲基化。一起，这些研究表明蛋白质-蛋白质相互作用是重要的调节因子。从头DNA甲基化和DNA甲基转移酶酶可以作为经典的共抑制因子一些转录因子的分子。在植物和一些真菌诱导RNAi基因沉默结果在转录后和系统基因表达的转录沉默。rnaimediated植物转录沉默常导致的结果在沉默基因的从头甲基化。二研究报告了类似的机制，从头甲基化在哺乳动物RNAi沉默细胞培养系统。当双链对应的启动子序列。基因被引入到哺乳动物组织培养细胞中，目标基因有效沉默伴随得‖字从头DNA甲基化的相应的启动子序列。关于这一点有一些争议这一观察的共性，因为其他报道的细节RNAi介导的DNA甲基化的情况下沉默[21]。

这种不确定性是由鼠标的研究缺乏Dicer基因细胞的重要组成部分RNAi系统。在一项研究中，缺失Dicer导致通常沉默着丝粒卫星转录重复，这表明RNAi系统要求对于这些元素的沉默状态。此外，在Dicer缺失细胞表现出异常的卫星转录，甲基化的量有减少着丝粒重复，表明RNAi维持这些甲基化标记的机器。通过相反，一个单独的研究发现没有卫星的变化在Dicer空胚胎干线DNA甲基化。进一步的工作显然需要验证是否有基于转录水平的基因沉默途径在RNAi哺乳动物。最初的证据支持它的存在，但它的存在效果似乎要少得多明显，那些报道在植物中。

2 遗传修饰对基因的影响:表达沉默

甲基化与转录抑制有关相关基因，和很大的努力一直投资于研究的机制，以支持这一关系。基本模式已经演变：在第一，甲基化可以直接抑制转录阻断转录激活因子结合同源DNA序列；第二，Mbps的认识甲基化的DNA和招募共抑制因子基因沉默直接表达。对于一些启动子甲基化介导的抑制作用最有效的在染色质背景下，表示这种压制系统的积极成分可能会依赖于染色质修饰。按照这一观察，Mbps与染色质重塑共抑制复合物[25]。

两个意想不到的方面的DNA methylationmediated，沉默系统最近已变得很明显：首先，DNA甲基化转移酶本身可能是在设置沉默的状态，二脱氧核糖核酸甲基化可以影响转录延伸率其特征性的抑制作用转录激活。

2.1 DNA甲基转移酶的转录抑制与染色质重塑相关酶

随着讨论的进行，DNA甲基转移酶显然可以招募一些在基因转录抑制因子沉默，导致脱氧核糖核

酸的甲基化。除此之外这种催化作用，现在有证据表明，转移酶在非酶在转录沉默中的作用。DNA甲基转移酶介导的沉默似乎依赖于修改染色质，因为每个酶的生化作用与组蛋白的甲基化和组蛋白去乙酰化酶。一项研究也表明这可以与ATP依赖的互动中染色质重塑蛋白hsnf2h。这些结果提高DNMTs双的可能性功能蛋白：沉默基因表达直接通过转录抑制和间接通过表观遗传修饰的胞嘧啶[26]。

2.2 甲基化与转录延伸

许多研究都有详细的效果基因启动子甲基化表达。值得注意的是，一个大的部分的正常基因组DNA甲基化是基因的内含子中发现，和外显子区域。基于质粒的实验报告基因已表明甲基化的一个基因的身体可以导致减少基因表达。最近的工作已经充分利用了一个集成的基因组报告系统以插入到转录起始位点的末端特异性末端。这项研究发现，减少表达对记者的影响不是由脱氧核糖核酸的影响造成的转录启动子甲基化间隙。相反，有一个减少核糖核酸II（Pol II）的入住率和减少染色质在体内的甲基化基因的比较相同的未甲基化的对照质粒的构成要素。基因甲基化在基因中的精确性调节表达仍知之甚少，但其存在可以明显抑制投票的能力通过甲基化区域的转录[27]。 3

3.1 甲基化CpG结合蛋白家族

特异性识别甲基的生化活性—CpG鉴定十多年前。的甲基化CpG结合域的表征（MBD）蛋白质基序负责结合甲基化CpG二核苷酸–促进生物信息学一个家庭的蛋白质，分享这个域。随着MBD3例外，其中含有氨基酸替换，防止结合甲基化CpG，哺乳动物的MBD蛋白（命名为MBD1–MBD4）的创始成员，MeCP2，所有的特异性识别甲基化CpG。一种新的MBP名叫Kaiso缺乏多动症，但识别甲基化通过锌指结构域[28]。所有Mbps可介导基因表达沉默。

他们实现这一目标的染色质重塑辅阻遏物含甲基化的区域的复合物。对比其他Mbps，MBD4是最好的特点是它的作用在脱氧核糖核酸修复，但一最近的报告表明，它可能也作为一个转录阻遏物。因为基本性质Mbps已在别处，在下面的章节我们将重点介绍一些最近的研究结果，这些蛋白质的功能基因沉默。

海草：与众不同

海草是一个双功能的DNA结合蛋白[29]，可以含二甲基化CpG DNA序列的识别二核苷酸或同源序列不包含甲基化CpG DNA。其识别甲基化CpG使用锌指结构域中存在的C-末端和通过关联介导的甲基化基因的抑制含N-CoR共抑制组蛋白去乙酰化酶复杂。

在非洲爪蟾胚胎，结果在枯竭的海草在中期囊胚的甲基化基因的表达过渡，确定该MBP作为一个角色甲基化依赖的转录阻遏物。非洲爪蟾Kaiso表达也抑制因素涉及通过其nonmethyl在Wnt信号转导通路—CpG结合活动。缺乏的小鼠Kaiso基因没有明显的表型，但他们显示肠肿瘤的耐药性。进一步这种非典型的MBP分析需要确定其甲基化依赖性抑制的相对贡献在哺乳动物系统中。 3.3 MBD1可以设置抑制DNA复制

过程中该和stancheva发现了一个新的沉默作用MBD1细胞周期的S期。在HeLa细胞中，MBD1可以与组蛋白H3的互动赖氨酸甲基转移酶9（H3K9）setdb1，甲基化修饰的偶联识别组蛋白甲基化修饰周围的染色质。在细胞周期的阶段复制时，MBD1–setdb1形成一个短暂的与染色质组装因子cafp150复杂，与基因复制的关联机械。这意味着一个计划MBD1–setdb1是针对CpG位点的甲基化在复制过程中。

在体内由隔离MBD1的结合位点，该和stancheva能够监视MBD1的影响基因沉默和染色质修饰的缺失细胞。正如预期的那样，MBD1结合区域染色质的组蛋白H3K9甲基化进行时MBD1不足。在一个实例中，MBD1—结合位点的启动子区域的基因，缺失导致激活这MBD1正常沉默基因。这些数据表明，MBD1在连接细胞周期中可能有特殊的作用组蛋白修饰和组蛋白修饰的表观遗传标记

蛋白质识别甲基化CpG和抑制转录

基因沉默的建立。

MBD1 null小鼠比较健康，但表现出一定的在神经发生轻度缺陷、空间学习和长期海马齿状回电。这还有待观察的表型MBD1敲除小鼠反映MBD1在染色质的作用修改已建立的组织培养细胞。 3.4 在肠癌和T系承诺MBD2细胞

MBD2敲除小鼠的健康和肥沃的土壤，但未知他们不能培养他们的后代的原因。在分子水平，成纤维细胞系来自MBD2—空小鼠降低了沉默的能力报告基因，证实mBD2在DNA甲基化作用—介导的沉默。遗传研究其中MBD2敲除小鼠已跨越到鼠标肠道癌模型表明MBD2是必需的对于肿瘤的形成，因为在其缺席的肿瘤形成明显减少。这些发现提高了的可能性，药物靶向可降低抗结肠癌。

虽然MBD2敲除小鼠表现出轻度的表型在实验室条件下，在methylationmediated不足沉默和肿瘤的重要作用进展型肠癌表明，其他缺陷，也许不明显的大体形态水平，在MBD2敲除小鼠存在。在与这一假设，一辅助性T细胞分化的深入分析为Th1和Th2细胞MBD2敲除小鼠有细胞因子的产生有明显的缺陷。通常情况下，Naı¨VE辅助性T细胞的诱导分化为Th1或Th2细胞抗原刺激时细胞。Th1细胞表达II型干扰素（IFNγ）和Th2细胞表达白细胞介素-4（IL-4）而不是相反。从MBD2敲除小鼠辅助性T细胞的出现实质性的混乱的IL-4和IFNG基因表达过程中Th细胞极化分化。类似的缺陷细胞因子基因的表达已被观察到在那ı¨T细胞DNMT1条件删除，这表明MBD2对DNA甲基化正常细胞因子表达所需的信号。分子生物学的研究旨在划定的作用在维护IL4基因沉默MBD2检测MBD2结合低乙酰化的染色质周围其启动子区域。IL-4的异位表达发生在那ı¨VE T细胞缺乏转录激活蛋白GATA-3，这通常是IL-4表达要求。因此，MBD2似乎IL-4表达的关键消声器未诱导的状态（即在适当的情况下通过识别甲基化的转录激活因子基因启动子区域（图5）。如果所以，那可能是有助于克服GATA-3沉默效应的基因活化过程中的表达Th2细胞的血统。同意这一假设，在野生型Th1细胞产生异位表达GATA-3从IL4基因和肿瘤位移呈剂量依赖性正常沉默基因的激活。这观察支持的观点，活化剂必须克服阈值的表观强加的沉默转录靶基因有效（图5和图6）。要测试这个模型的通用性，其他细胞系将需要检查的类似的细节. 4

在人类的MECP2基因突变导致雷特综合征，一种使人衰弱的神经系统疾病，影响10000女性的活产婴儿。一具有许多功能的鼠标模型，让人联想到雷特综合征是由MeCP2缺失了小鼠基因。微阵列基因表达在MECP2-null小鼠脑组织分析，其中雷特表型的表现，表明基因的微妙变化表达。在该组的上调基因是2糖皮质激素诱导的基因（SGK和FKBP5）和在糖皮质激素信号转导的基因通路（POMC）。

重要的是，在SGK的缺陷观察之前表现是FKBP5基因表达雷特喜欢在MECP2-null小鼠的表型，表明这些变化并不是一个次要的结果症状。因此，可以想象，MeCP2参与在调节基因的表达脑内糖皮质激素信号转导通路。这个发现MeCP2是直接关联的野生型两个基因的甲基化启动子区域老鼠（图7）与这一观点相兼容。进一步的工作需要评估MeCP2参与程度在调节糖皮质激素靶基因，建立这种基因表达改变的相关性人类混乱。因为甲基化在调节中很重要印迹基因的表达，它已被提出MBP基因敲除小鼠可能会显示错误调节印记基因表达[29]。

初步研究未能识别这些缺陷，但最近几印迹基因，包括DLX5和Dlx6，UBE3A，有据报道，显示大脑中正常表达缺失基因敲除小鼠组织。MeCP2的绑定到区域在体内的Dlx6基因和招募组蛋白去乙酰化酶1创建的沉默染色质的地区。此外，MeCP2的Dlx6轨迹结合相关随着环的染色质结构的形成可能需要沉默的侧翼基因。采用候选基因法，两组已确定的ca2c诱导神经元的基因脑源性神经营养因子（BDNF）为直接目标为抑制神经细胞的基因。MeCP2附近的BDNF诱导型启动子结合，在那里与共抑制分子Sin3A Associates，大概维持BDNF基因的抑制状态。在ca2c信令，MeCP2成为磷酸化，从启动子为BDNF基因被激活。在培养的神经元MECP2-null小鼠，基底（诱导）BDNF的

有针对性的神经元MeCP2的结合基因

表达上调两倍，表明MECP2进行直接的贡献对该启动子的沉默。脑源性神经营养因子的水平钙诱导的细胞中的表达似乎是不受影响的通过基因的缺失。其他几个基因的研究在细胞培养过程中的神经细胞分化表明这个蛋白在调节神经元的广泛作用基因表达[30]。

微阵列基因表达分析MeCP2基因，不是一个全球性的调节器因为一些基因表达，放开它缺席。相反，MeCP2似乎调节不同甲基化基因亚群。最近的一项研究了解MBD蛋白占有确定MeCP2结合到不同的位点不占用其他Mbps在体内。因此，MeCP2似乎没有竞争其他Mbps的访问甲基化CpG核苷酸，但局限于几个基因组结合位点。

MeCP2的结合特性，利用体外分析结合位点选择法建立基因甲基化CpG序列需要在运行四个或更多的/ T碱基对（A / T）R4、高效的DNA结合。片段与MeCP2在体内也含有额外的（A / T）R4主题，表明该识别序列是用于细胞。此外，MeCP2的结合位点在它的两个已知靶基因，BDNF和Dlx6，含有甲基CpG通过（A / T）R4的图案。因此，至少一部分的目标MeCP2基因特异性似乎干这个附加序列特异性。对脱氧核糖核酸的要求除了甲基化CpG序列可能也适用于其他Mbps，因为MBD1的一种主要形式包含二脱氧核糖核酸结合结构域。另外，其不需要一但连续两个甲基化CpG二核苷酸为高效甲基化特异性核酸结合。到目前为止，只有MBD2似乎是甲基化CpG位点特异性单独。正在努力了解基因的作用在MECP2-null小鼠看到缺陷和原因在人类的雷特综合征的补充研究。 在两栖类。非洲爪蟾胚胎耗尽MeCP2存活不过去神经胚形成阶段在神经基因表达的定义缺陷，这表明MeCP2更具有的作用在两栖动物的发展比在哺乳动物中。MeCP2结合到启动子区的非洲爪蟾在hairy2a基因和参与。什么时候是缺乏MeCP2表达增加，hairy2a，导致胚胎过多发生。是否哺乳动物的同源基因异常是hairy2a一个基因缺乏的结果还不知道。

一般来说，基因敲除小鼠的表型由于单一分子的异常功能几个小缺陷的途径或总的细胞过程.这个蛋白具有新颖的功能，是可能的无关的转录抑制也必须保持在头脑里。事实上，最近的一份报告表明MeCP2为选择性剪接调制器通过相互作用的相互作用RNA结合蛋白1。似乎很可能雷特未来医疗干预的理性探讨综合征将取决于继续努力理解在MECP2突变小鼠的缺陷。 5

一个完整系统的绝对要求甲基化在小鼠表明，这种表观遗传修饰在发展中起着至关重要的作用，然而，研究目的是了解影响的范围甲基化在发展上几乎没有划伤表面。酶的分子特性和蛋白质在放置和解释的脱氧核糖核酸甲基化信号，最近，可用性这些组件的鼠标的敲除线提供工具来操作和分析甲基化系统在体内的正常功能。利用这些信息迅速展开的信息试剂可能是非常重要的，我们的了解基本的表观遗传沉默机制在未来可能有广泛的影响遗传性疾病和癌症的治疗。

展望