荧光定量PCR实验案例介绍

实验分组：A 正常组；B 阴性对照组；C XXXX-1转染组；D XXXX-2转染组；E XXXX-3转染组

第一个筛选实验：荧光定量PCR实验 实验分组： NO 1 2 3 4 5

样本编号 A B C D E 实验试剂：Trizol Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I) Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR仪ABI 7900型；引物由primer3.0软件设计并由嘉美生物合成。步骤(略)。

结果数据：Ct（基本循环数）；ΔCt（基本循环与内参循环数差值）；ΔΔCt*（最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ） ：目的基因mRNA相对含量（* 相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth，et al. (2001) METHODS 25 402–408）。

扩增曲线：在实时荧光PCR扩增反应中，荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段：基线期，指数期初期，指数期，平台期，在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线，阴性对照(模板为水)无显著荧光信号，提示荧光定量PCR反应程序正常运行，目的基因得到有效扩增，实

验操作规范，试剂符合实验要求。

熔点曲线：从软件中显示形状只有一个峰值，没有出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一，有利于结果分析。

CT Sample 1 1 1 2 2 2 3 3 3

26.1312 26.3320 26.0145 27.0101 27.0077 27.0584 28.1032 28.7212 28.5034

ΔCт 5.7691 6.0975 5.6754 5.9786 6.0073 6.0103 8.3378 9.3670 9.3785

ΔΔCт -2.2238 -1.54 -2.3175 -2.0143 -1.9856 -1.9826 0.3449 1.3741 1.3856

RQ 4.6712 3.7203 4.9847 4.0398 3.9603 3.9520 0.7874 0.3858 0.3827

RQ mean 4.4587 3.9841 0.5186

SD 0.6585 0.0485 0.2327

4 4 4 5 5 5 1-内参 1-内参 1-内参 2-内参 2-内参 2-内参 3-内参 3-内参 3-内参 4-内参 4-内参 4-内参 5-内参 5-内参 5-内参

28.0210 28.0042 27.9142 26.3742 26.5004 26.6316 20.3621 20.2345 20.3391 21.0315 21.0004 21.0481 19.7654 19.3542 19.1249 20.2147 20.3621 20.5572 19.31 19.8875 19.6504

7.8063 7.21 7.3570 7.0578 6.6129 6.9812

-0.1866 -0.3508 -0.6359 -0.9351 -1.3800 -1.0117

1.1381 1.2753 1.5539 1.9120 2.6027 2.0163

1.3224 2.1770

0.2119 0.3723